目的:建立一种基于稳定元素标记和电感耦合等离子体质谱仪器的定量免疫分析方法，将其应用于血清淀粉样蛋白A（SAA）检测，并进行性能评价。方法:以磁珠作为固相载体，以元素钬（Ho）作为标记元素，构建基于双抗体夹心法的免疫检测体系。对磁珠抗体结合比例、元素抗体用量、反应时间等因素进行优化，确定检测体系最佳反应条件。根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）系列文件对检测体系进行方法学确认和性能验证，具体包括空白检出限（LOB）、线性范围、准确度、特异性、不精密度、干扰实验等。最后收集免疫比浊法检测后SAA血浆样本82份，采用新建检测体系进行检测，并对二者的检测结果进行Pearson相关性分析。结果:亲水性链霉亲和素和生物素化抗体最佳结合比例为1∶0.15，元素标记抗体用量为3 μl，两反应步骤孵育时间分别为40、30 min。新建检测体系LOB为0.6 μg/L，在0~1 200 μg/L范围内线性相关性良好（ R2=0.998 9， P<0.001），高值样本与低值样本批内精密度分别为9.42%、7.95%，批间精密度分别为14.56%、13.56%，回收率为96.01%~104.76%，与降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）交叉反应率分别为0.45%，0.015%，均<0.5%。当甘油三酯浓度≤35.5 mg/L、胆红素浓度≤0.52 mg/L、血红蛋白浓度≤2.4 g/L时，检测的干扰偏倚均<10%。新建检测体系与免疫比浊法检测82份SAA血浆样本的结果分别为12.65（4.45，59.03）、18.23（9.33，68.72）mg/L，相关性良好（ R2=0.983， P<0.001）。 结论:本研究建立的以Ho为标记物的SAA定量免疫检测方法精密度高、准确度好、特异性高、线性范围宽，可满足临床检测需求。

目的 在基于生物素-链霉亲和素(biotin-avidin/streptavidin,BAS)的化学发光技术检测人绒毛膜促性腺激素β亚基(β-human chorionic gonadotropin,β-hCG)和孕酮(progesterone,Prog)时,建立一种简易、有效的抗生物素干扰方法.方法 采用两种浓度链霉亲和素磁珠(streptavidin coated magnetic micro particles,M)检测不同生物素浓度的高、中、低水平的β-hCG和Prog血清,通过回收试验评价两种浓度M的抗生物素干扰能力以及采用低浓度M的校准曲线时高浓度M检测的准确度.结果 ①β-hCG和Prog的抗生物素干扰能力在低浓度M(0.72 mg/ml)时分别为100 和 25 ng/ml,在高浓度M(1.44 mg/ml)时分别为 500 和 50 ng/ml.②使用和低浓度M相同的校准曲线时,高浓度M对于生物素浓度在 500 ng/ml以下的β-hCG三个水平的回收率均在90%～110%之间;对于生物素浓度在50 ng/ml以下的高、中水平的Prog,其回收率在90%～110%之间.结论 在基于BAS化学发光技术检测血清β-hCG和Prog时,采用高浓度M(1.44 mg/ml)是一种简易、有效且可靠的抗生物素干扰方法.

目的 在传统的时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术基础上,结合生物素-亲和素放大技术和磁性微粒技术优势,建立一项新方法 进行血清中糖类抗原153(carbohydrate antigen 153,CA153)含量的测定.方法 利用磁性微粒表面的链霉亲和素分子与生物素-CA153包被抗体快速高效结合,从而在固相载体磁性微粒表面形成双抗体夹心复合物.并对新方法 的各项性能指标进行评价.结果 获得的CA153 TRFIA线性方程为y=54 638x+7 052.2,R2=0.9995;该方法 的灵敏度为0.48 U/mL,批内和批间的变异系数分别为2.09％～5.95％,1.54％～7.15％,平均回收率为94.48％,与其他肿瘤标志物无明显干扰,正常范围参考值为0～35U/mL.用该方法 检测乳腺癌与健康体检者血清的CA153结果 与化学发光法一致,相关系数为0.9782.结论 该方法 灵敏度优于传统技术,是TRFIA的一种新方法,反应时间短,操作简单,敏感度、特异性、准确度等均符合临床应用要求.

目的 建立一种基于时间分辨荧光纳米颗粒的磁分离均相免疫分析方法并用于检测降钙素原(PCT)重组抗原.方法 以PCT单克隆抗体偶联铕离子荧光微球为检测抗体,另一株PCT单克隆抗体偶联生物素作为固相抗体,建立一种通过表面修饰有链霉亲和素的磁珠分离铕离子荧光微球-检测抗体-降钙素原-固相抗体-生物素复合物的均相免疫分析方法.用该法检测PCT重组抗原,通过SigmaPlot分析该法的最低检测限.结果 PCT重组抗原的标准曲线匹配二次函数,函数方程为Y=19170.12+ 75493.74X-26.00X2(r=0.9986),PCT重组抗原检测灵敏度为0.04 ng/ml.结论 铕离子荧光微球可作为标记物应用于磁分离均相免疫分析方法,并在PCT重组抗原检测中获得较高的检测灵敏度.

水稻异源三聚体G蛋白系统中的非典型γ亚基GS3,是一个控制籽粒大小的主效数量效应基因座,在调节籽粒大小中发挥负调控因子的功能.BioID (proximity-dependent biotin identification)为邻近蛋白标记技术,其工作原理是生物素连接酶能使其周围的蛋白带上生物素,同时生物素又能和链霉亲和素紧密结合,所以能够利用链霉亲和素偶联的磁珠富集目标蛋白.该技术具有灵敏、高效和周期短等特点,为筛选互作蛋白提供了新方法.为了解析GS3的蛋白调控网络,该研究以水稻原生质体为材料,采用BioID 技术对GS3在水稻中的互作蛋白进行了筛选.Western-blot结果表明:融合蛋白BirAG-GS3在原生质体中成功表达并生物素化GS3邻近蛋白.使用链霉亲和素磁珠富集生物素化后的蛋白,并进行蛋白质谱测序,获得了与GS3邻近的可能存在直接或间接互作的蛋白.将获得的蛋白进行功能富集与注释,并构建蛋白-蛋白互作网络.对部分蛋白进行了BiFC 验证,发现GS3可能与ICL、PPDK、RPN7和RH15发生相互作用,涉及能量代谢的调节、种子淀粉物质的储存、泛素-蛋白酶体系统以及凋亡途径等生物过程.

目的 利用化学发光免疫分析快速法定量检测人血清中NT-proBNP.方法 将生物素和吖啶酯衍生物分别标记识别NT-proBNP抗原的2个抗体,当抗原与试剂混合后形成的双抗体夹心复合物被链霉亲和素磁珠抓捕分离,复合物在激发液的作用下发光,该相对发光强度(RLU)与样本中的NT-proBNP浓度呈正相关.结果 性能分析显示,这种检测方法的线性范围是8 pg/ml ～2 0000 pg/ml,线性相关系数(r)≥0.999,检测下限(LOB) ≤6 pg/ml,其批内精密度≤5％,批间精密度≤8％,添加回收率在88.3％ ～ 106.1％,稀释回收率在93.4％ ～ 106.8％.与罗氏ProBNPⅡ试剂盒比对,检测临床样本的浓度相关性为r2=0.979 7.结论 该试剂盒的优良性能为临床检测人血清中NT-proBNP含量提供了坚实的基础.

目的:采用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选获得一组已知和未知肝癌血清肿瘤标志物的适配体,为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法.方法:收集50例首次经诊断证实为原发性肝癌的患者血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体.先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD 18-T载体连接进行转化、挑选单克隆送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值).结果:经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个.特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91％以上.结论:利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与肝癌患者血清特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗肝癌血清的能力,有可能为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法.

目的:研发一种S100B蛋白新型检测试剂及仪器,为颅脑创伤疾病的诊疗提供参考.方法:将S100B蛋白单克隆抗体与生物素(Biotin)、S100B蛋白抗体与辣根过氧化物酶(HRP)、链霉亲和素与羧基磁珠分别按照一定比例进行交联并稀释,制备R1、R2、R0试剂,再用校准品稀释液稀释S100B蛋白抗原制备校准品.S100B蛋白新型检测仪器由试剂模块、反应模块、清洗模块、检测模块4个部分组成,具体由试剂盘、样本盘、磁微粒盘、装载台、反应盘、清洗盘和检测盘构成.结果:成功制备了用于颅脑创伤患者S100B蛋白检测的新型试剂,研发了配套的化学发光免疫分析仪器,实现了加样、反应、清洗、检测的模块化和自动化.经过临床测试,该试剂和仪器可以准确获得S100B蛋白的浓度.结论:S100B蛋白新型检测试剂和仪器可以提供S100B蛋白的快速批量检测,将为颅脑创伤病情的判断提供重要保证.

赭曲霉毒素(ochratoxins)主要是由青霉菌Penicillium和曲霉菌Aspergillus产生的有毒次级代谢产物,常见于发霉或发酵的农产品中,其中赭曲霉毒素A (ochratoxin A,OTA)毒性最强且最为普遍.OTA是粮食作物和饲料的重要污染物,在加工、储存或运输过程中均可产生,具有肾毒性和免疫毒性,可通过蓄积作用发挥毒性效应,对人类和动物健康造成严重威胁.本研究通过将OTA单克隆抗体包被于纳米磁珠(magnetic nanoparticles,MNPs)表面,获得具有免疫活性的磁珠抗体复合物(MNPs-Anti OTA),并制备生物素标记的偶联抗原OTA-BSA-Bio,后续采用链酶亲和素标记的纳米金颗粒(Strep-HRP-AuNPs)催化底物进行信号检测,最终建立了OTA高灵敏检测方法(MNPs-bs-AuNPs-ELISA).在最优条件下,经计算该方法检测下限(IC10)为0.01ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.02-0.73ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.13ng/mL.与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为4.3％和8.1％,对其他常见真菌毒素AFB1、ZEN、FB1、DON、CIT和PAT均无交叉反应.玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达85.6％-115.7％,对天然样本中OTA含量的检测结果表明,该方法与LC-MS/MS相关性良好.本研究建立的MNPs-bs-AuNPs-ELISA可满足谷物及饲料样本中OTA的快速、高灵敏度定量检测,成本较低,具有很好的应用前景.

目的 建立一种低浓度大体积样品中快速捕获富集大肠埃希菌O157∶H7的方法. 方法 利用链霉亲和素-生物素结合特性,将生物素标记大肠埃希菌O157∶H7特异性适配体与链霉亲和素磁珠相结合,制备捕获磁珠,捕获样品中的大肠埃希菌O157∶H7,通过平板培养计数法检测捕获效率. 结果 通过优化反应条件,建立的适配体捕获磁珠富集法在O157∶ H7低浓度样品(103 cfu/ml)中捕获效率≥92.49％,大肠埃希菌O157∶H7浓度101 cfu/ml时捕获效率为96.08％,高浓度样品(107 cfu/ml)中捕获效率≥56.52％,在模拟实际样品(牛奶、果汁、汽水)中捕获效率均≥70％,与PCR法结果一致. 结论 基于免疫磁珠技术建立的大肠埃希菌快速捕获富集方法,具有特异性强、灵敏度高操作简单、成本低廉等特点,在实际检测中具有良好发展前景.