目的:探究溶质载体家族24成员5（SLC24A5）的表达与皮肤黑色素瘤（SKCM）细胞增殖和侵袭的关系，对SLC24A5作为SKCM的潜在生物标志物和治疗靶点的可能性进行初步探讨。方法:利用生物信息学的方法搜集相关信息，随后建立敲低SLC24A5的MEL-526和SK-HEL-5黑色素瘤细胞模型，通过Western blot与实时定量聚合酶链式反应（qPCR）实验验证SLC24A5的敲低效率，并探讨敲低SLC24A5对SKCM细胞增殖和侵袭的影响。结果:SLC24A5在SKCM组织中的表达显著高于癌旁正常组织，高表达SLC24A5的患者的预后更差。敲低SLC24A5后，MEL-526和SK-HEL-5细胞的增殖受到抑制。结论:SLC24A5在SKCM的进展中扮演着重要角色，有成为SKCM的治疗靶点和生物标志物的潜力。

人核仁磷酸化蛋白1(Nucleolar and coiledbody phosphoprotein 1,NOLC1)在癌症的发生发展过程中起着至关重要的调控作用,为探讨NOLC1对肺癌细胞的作用,本研究通过Gateway系统构建重组NOLC1腺病毒载体,成功包装NOLC1腺病毒后,分别感染正常人类胚胎肺细胞(HEL)和非小细胞肺癌细胞(A549细胞),过表达NOLC1.通过MTT实验、AnnexinⅤ-APC/PI双染法和线粒体膜电位实验,证明与HEL细胞相比,NOLC1的过表达对A549细胞的活性降低、凋亡增加、线粒体膜电位下降影响较为显著;通过Real-time PCR检测Caspase家族、TNF与受体家族和BCL2家族基因的表达,发现过表达NOLC1明显上调了 A549细胞中促凋亡基因的表达,下调了抗凋亡基因的表达,其中两种重要的促凋亡蛋白CASP8和BAX均显著上调,但是在HEL细胞中这种影响不明显.研究结果表明过表达NOLC1蛋白通过对线粒体通路和死亡受体通路的共同作用,对非小细胞癌具有显著的抗肿瘤活性.

在转录延伸过程中,P-TEFb激酶(由激酶CDK9 和Cyclin T1 组成的二聚体)是释放停滞的Pol Ⅱ这一步的关键调节因子.在人类细胞中,它可参与形成三个更大的复合体,即超级延伸复合体(super elongation complex,SEC)、BRD4/P-TEFb 和 7SK snRNP,其活性在前两者中不被抑制,而在后者中被抑制.除 P-TEFb 外,SEC还含有AFF1 或 4、AF9 或ENL、ELL1、2 或 3,EAF1 或 2 等无酶活亚基,这些亚基被认为可通过P-TEFb影响转录延伸.本课题组前期的研究和其他实验室的研究工作均已表明AFF1、AF9 和ENL亚基均可调控转录启始,但尚不清楚 AFF4 是否具有相似的功能.在调控基因表达的选择性方面,近期有研究表明 BRD4/P-TEFb在人类结直肠腺癌细胞DLD-1 中主要负责除热激基因以外的其他基因的停滞释放,而SEC负责热激基因的停滞释放.为了深入理解AFF4 的功能,本研究利用RNA干扰技术在人类红系白血病细胞HEL中敲低了AFF4,发现RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)的羧基端重复区(C-terminal domain,CTD)内第二个丝氨酸(Serine 2,Ser-2)的磷酸化水平降低.利用RNA-seq和CUT&Tag确定了AFF4 的直接靶基因,利用ChIP-seq和PRO-seq发现AFF4 对转录启始的影响不明确、对Pol Ⅱ的停滞释放的调控不局限于热激基因,利用ChIP-qPCR发现AFF4 缺失降低了P-TEFb的染色质结合.上述研究结果表明,AFF4 对Pol Ⅱ的停滞释放的调控可能具有一定的细胞类型特异性,即在一些细胞内仅调控热激基因的停滞释放,而在另一些细胞中调控的对象却不仅限于热激基因.

目的:探讨复方黄黛片(Compound Realgar and Natural Indigo Tablet,CRNIT)灭活兔血清对人红白血病(Human Erythroleukemia,HEL)细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响;方法:制备复方黄黛片、羟基脲片、生理盐水三组灭活含药兔血清,用不同浓度的血清处理HEL细胞,通过CCK-8检测细胞增殖-毒性,通过Annexin V/PI双染色流式细胞分析检测细胞凋亡,Cell Cycle Staining Kit流式细胞分析检测细胞周期.结果:1.在一定浓度范围内,复方黄黛片灭活兔血清对HEL细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性,且强于羟基脲片组、生理盐水组(P＜0.05);2.对比复方黄黛片灭活兔血清处理HEL细胞24 h、48 h抑制率,提示其抑制作用呈时间依赖性;3.在一定浓度范围内,复方黄黛片灭活兔血清对HEL细胞凋亡的促进作用呈浓度依赖性,且优于羟基脲片组和生理盐水组(P＜0.05);4.经复方黄黛片灭活兔血清处理24 h,处于G1期的HEL细胞较对照孔增多.结论:复方黄黛片灭活兔血清能有效的抑制HEL细胞增殖,促进细胞早期凋亡,并影响HEL细胞周期.

目的 研究JAK2V617F突变阳性骨髓增殖性肿瘤(MPN)组织中JAK2V617F突变量与磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)、细胞因子信号转导抑制蛋白1(SOCS1)、含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)表达的关系,并探讨JAK2抑制剂鲁索替尼(ruxolitinib)对JAK2V617F突变阳性人红白血病细胞系HEL细胞的增殖和HEL细胞中SOCS1、SHP1表达的影响.方法 纳入2012年7月至2016年8月于河北省人民医院和保定市第一医院就诊的48例JAK2V617F突变阳性的MPN患者为MPN组,同期24例贫血患者为对照组.采用免疫组织化学法检测骨髓组织标本中p-JAK2、SOCS1和SHP1的蛋白表达水平.SOCS1、SHP1蛋白表达量与JAK2V617F突变量的相关分析采用Spearman等级相关分析.用不同浓度(50、100、250、500、1000 nmol/L)的鲁索替尼处理HEL细胞后,采用CCK-8法检测HEL细胞的活力,qPCR法检测MPN组织和HEL细胞中JAK2V617F突变量以及HEL细胞中JAK2、SOCS1、SHP1 mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测HEL细胞中JAK2、p-JAK2、SOCS1、SHP1的蛋白表达水平.结果 (1)MPN组织中JAK2V617F/JAK2比值为(57.33±20.82)%,对照组为0%.MPN患者骨髓细胞质中p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白质表达量与对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.01).(2)MPN组织中SOCS1、SHP1蛋白表达量均与JAK2V617F突变量呈负相关(r=-0.648、-0.692,P均<0.05).JAK2V617F/JAK2比值<50%MPN患者的SOCS1、SHP1蛋白表达水平高于JAK2V617F/JAK2比值≥50%的MPN患者(P均<0.01),p-JAK2的蛋白表达水平低于JAK2V617F/JAK2比值≥50%者(P<0.01).(3)250 nmol/L鲁索替尼处理24、48、72 h后,HEL细胞活力分别为(60.06±3.87)%、(52.05±2.88)%、(36.43±2.01)%.随着鲁索替尼浓度的增加,HEL细胞中JAK2的mRNA和蛋白表达与p-JAK2的蛋白表达水平逐渐降低(P<0.01,P<0.05),SOCS1和SHP1的mRNA和蛋白表达逐渐增加(P均<0.01).结论 鲁索替尼能够抑制HEL细胞中JAK2的mRNA和蛋白表达及其磷酸化水平,增加SOCS1、SHP1 mRNA和蛋白表达,降低HEL细胞的活力.

目的 根据ISO15189认可要求评价全自动单核苷酸多态性分析仪i-densy IS-5320平台检测骨髓增殖性肿瘤患者JAK2基因V617F突变.方法 仪器性能验证.选择2014 年12月至2017年2月间复旦大学附属华山医院JAK2 基因 V617F 突变阳性外周血标本20 例,JAK2 基因V617F突变阴性的外周血标本20例,以TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR作为对照方法,经测序方法验证评价仪器直接检测全血JAK2基因V617F突变的准确性.使用全血样本分别评估检测平台的检测重复性、携带污染与交叉污染,以及抗干扰能力.取HEL细胞与HCT116细胞为突变型对照和野生型对照,配制12种不同突变细胞比例样本进行检测,以此评价检测突变负荷的能力.结果 i-densy IS-5320平台与TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法检测完全一致;批内重复性与批间重复性为100%;未观察到携带污染与交叉污染;高胆红素(总胆红素:＞20.4 μmol/L)与高甘油三酯(甘油三酯:＞1.8 mmol/L)血样本对突变检测无明显干扰;该平台能够稳定检出负荷低至0.25%的突变.结论 i-densy IS-5320可实现对全血直接进行JAK2基因V617F突变检测,具备较高的灵敏度、准确度和稳定性,操作简便,能够达到临床对突变的检测要求.

目的·研究免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)患者来源的骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMCs)体外生存能力、细胞因子表达的变化以及对巨核细胞生物学行为的影响.方法·全骨髓贴壁培养法培养7名ITP患者及5名正常对照者(normal controls,NC)来源的BMCs,流式细胞术检测BMCs基础凋亡率并进行表型鉴定,CCK-8法检测细胞增殖能力.佛波酯诱导HEL细胞分化并将诱导后的HEL(induced HEL,inHEL)分为3组:inHEL单独培养组(a组)、inHEL与ITP患者来源的BMCs共培养组(b组)、inHEL与NC来源的BMCs共培养组(c组),72 h后检测3组inHEL的凋亡率及CD41a、CD42b的表达状况.实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附试验检测BMCs中细胞因子IL6、IL11、TPO、SCF的基因及蛋白表达水平.结果·与NC相比,ITP患者来源的BMCs体外增殖减弱(第4日,P=0.039;第6、10日,P=0.009;第8日,P=0.007),基础凋亡率增加[早期凋亡率(AV+PI-),P=0.036;晚期凋亡率(AV+PI+),P=0.003;总凋亡率(AV+PI-/+),P=0.004];IL6基因及蛋白表达减少、SCF基因表达减少(均P=0.000),而TPO及IL11表达量无明显差别.c组细胞CD41a表达量与a组相比显著增加(P=0.000);b组细胞CD41a表达量与a组相比有所增加(P=0.015),但仍显著少于c组(P=0.000).与a组相比,b组、c组细胞的早期及总凋亡率以及c组细胞的晚期凋亡率均明显降低(均P=0.000),而b组细胞晚期凋亡率无明显变化;与c组相比,b组细胞的晚期及总凋亡率均明显升高(均P=0.000).结论·ITP患者来源的BMCs在体外共培养条件下对巨核细胞分化及生存的支持能力减弱,其机制与ITP来源的BMCs细胞因子IL6、SCF的表达量减少相关.

目的 研究美洲大蠊提取物对人胚肺成纤维细胞(HEL)增殖的影响,并初步探讨其作用机制.方法 通过体外培养HEL细胞,采用MTT法观察美洲大蠊提取物对HEL细胞增殖的抑制作用;天狼星红法测定细胞胶原的分泌含量;比色法检测细胞中HYP的含量水平;RT-PCR检测COL I和CTGF mRNA的表达变化.结果 剂量在90～ 110 μg/ml时,美洲大蠊提取物呈剂量和时间依赖性抑制HEL细胞的增殖,降低胶原含量,抑制HYP分泌,有效控制COL I和CTGF mRNA的表达.结论 美洲大蠊提取物能够抑制肺成纤维细胞的增殖,并降低细胞外基质分泌水平,对肺纤维化的发生和发展起到一定的抑制作用.

目的 研究青蒿琥酯(ART)体外对人巨细胞病毒(HCMV)实验室标准株及耐药株的抗病毒作用,了解分次给药法足否能增强ART抗病毒效应.方法 1.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定ART的细胞毒性,计算ART对人胚肺成纤维细胞(HEL)的最大无毒浓度(TC0)与半数中毒浓度(TC50).2.ART抗HCMV作用检测:以HCMV标准株及耐药株感染HEL后,再加入含有不同浓度ART的新鲜培养基,设更昔洛韦(GCV)对照、细胞对照和病毒对照,培养7～10d,待病毒对照组病变达+++～++++时,采用MTT比色法测定OD490值,计算受试药物病毒抑制率,Probit回归法计算药物对HCMV的半数抑制浓度(IC50).3.测定ART分次给药对HCMV AD169株的抗病毒效应:实验分3组,1组:药物总量一次性给予;2组:药物总量分3次,每天给药1次;3组:药物总量分6次,每天给药3次.以GCV组作为对照,MTT法测定各组OD490值,并计算各药物浓度组的病毒抑制率,采用SPSS 18.0统计软件,对各组OD值进行单因素方差分析,比较各组间差异.结果 1.ART在62.5 μmol/L以内未见明显细胞毒性作用,TC0和TC50分别为62.5 μmol/L和171.7 μmol/L.2.在5 μmol/L、15 μmol/L及30 μmol/L时,ART与GCV对HCMV AD169株生长均有明显的抑制作用,二者比较差异无统计学意义,其中GCV IC50为3.49μmol/L,而ART IC50为2.17 μmol/L,ART治疗指数为28.8,GCV治疗指数为716.3.另外,ART对HCMV耐药株生长仍有明显的抑制作用,而GCV抑制作用明显下降,二者比较差异有统计学意义,其中GCV IC50为44.4 μmol/L,ART IC50为2.5 μmol/L.3.在15 μmol/L及30 μmol/L浓度下,ART每天2次给药较每天1次给药及单次给药,对病毒的抑制率有显著提高,差异有统计学意义(P＜0.01);而GCV同样按上述方法给药,则对病毒抑制率影响不大(P＞0.05).结论 1.ART浓度在62.5μmol/L以下时,对HEL无明显毒性.2.ART对HCMV标准株及耐药株均有明显的抗病毒效应.3.ART每大分次给药比单次给药及一次给药更能发挥其抗病毒作用.4.ART不良反应轻微,加上其与现有抗HCMV药物可能不同的独特的抗病毒作用机制,临床应用不易产生耐药性,因此非常有望成为新一代的抗HCMV药物.

已有研究证实蟾毒灵具有抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用,在白血病治疗中疗效显著,然而其机制尚未阐明.本研究试图探讨蟾毒灵对人红系白血病(HEL)细胞增殖,肾母细胞瘤基因1(Wilms' tumor 1 gene,WT1)甲基化的影响及其可能的作用机制.本研究采用不同浓度的蟾毒灵处理HEL细胞,观察细胞形态、增殖情况和细胞周期,采用RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学法检测WT1的mRNA和蛋白表达水平,并用甲基化特异性分析WT1的DNA甲基化和DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)的蛋白表达水平.研究结果表明,蟾毒灵对HEL细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,抑制率为23.13％～84.62％.在蟾毒灵处理的HEL细胞中观察到典型的凋亡形态特征;细胞周期增殖指数由75.45降至49.67;WT1 mRNA及其蛋白表达水平随着蟾毒灵剂量的增加而逐渐降低,同时WT1基因的甲基化状态由未甲基化状态变为部分或完全甲基化状态.而蟾毒灵处理后DNMT3a蛋白的表达水平逐渐增加,呈剂量依赖性.我们的研究初步说明蟾毒灵不仅能显著抑制HEL细胞增殖,阻滞G0/G1期细胞周期,还能诱导细胞凋亡,下调WT1的表达水平.