目的:分析陕西省首例人感染G4基因型欧亚类禽H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）的基因特征。方法:采集患者咽拭子标本，接种MDCK细胞进行病毒分离获得毒株，采用全基因组深度测序方法获得分离株的8个基因节段序列，通过GenBank数据库中Blast程序进行核苷酸同源性分析，构建系统进化树，分析病毒基因特征。结果:病例咽拭子标本经实验室确诊为EA H1N1 SIV，后分离毒株命名为A/Shaanxi-Weicheng/1351/2022（H1N1v）。同源性分析显示，该分离株的PB2、NP、HA、NA和M基因均与A/swine/Beijing/0301/2018（H1N1）核苷酸同源性最高，分别为98.29%、98.73%、97.41%、97.52%和99.08%。进化树显示，该分离株属于G4基因型EA H1N1 SIV，其中PB2、PB1、PA、NP和M基因来自pdm/09 H1N1，HA和NA基因来自EA H1N1，NS基因来自三源重配H1N1。其HA蛋白裂解位点为IPSIQSR↓G，为低致病性流感病毒的分子特征。NA蛋白未出现与神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。PB2蛋白701N、PA蛋白P224S突变、NP蛋白Q357K突变、M蛋白P41A突变和NS蛋白92D均说明其对哺乳动物的适应性增强。结论:该患者为陕西省首例人感染G4基因型EA H1N1 SIV病例，该病毒为低致病性，但其对哺乳动物的适应性增强，需要加强对此类SIVs的监测。

目的:比较H1N1流感病毒疫苗株在MDCK和MDCK-G1细胞中的最佳培养条件、产毒量、病毒滴度和细胞代谢情况。方法:通过棋盘法摸索两种细胞的最佳种毒条件，然后比较2株细胞在最佳条件种毒后的血凝滴度、半数组织感染剂量(TCID 50)、葡萄糖和乳酸的代谢情况。 结果:MDCK-G1细胞以感染复数(MOI)＝0.001、1 μg/ml TPCK胰酶接种H1N1流感病毒后，72 h时血凝滴度达到峰值(1∶512)，病毒滴度为10 7.4TCID 50/ml；MDCK细胞以MOI＝0.000 1、1 μg/ml TPCK胰酶接种H1N1流感病毒后，72 h时血凝滴度达到峰值(1∶256)，病毒滴度为10 6.6TCID 50/ml。 结论:MDCK-G1比MDCK细胞更适合流感病毒的增殖。本研究为细胞基质流感疫苗的研究提供了参考数据。

目的:研究不同基因型别乙型脑炎病毒在不同细胞系上的生长特点，为乙脑病毒的研究中细胞系的选择提供科学依据。方法:选择BHK-21、Vero、C6/36、PK-15、DF-1、N2a、SH-sy5y和MDCK细胞系，通过空斑测定法和RT-qPCR法评价基因1型(G1, NX1889株)、基因3型(G3, P3株)和基因5型(G5, XZ0934株)乙脑病毒在上述细胞系中的增殖能力。结果:3种基因型别乙脑病毒在BHK-21、Vero、C6/36、DF-1、N2a和PK-15细胞系中存在明显的细胞病变效应(CPE)，在同一种细胞系中引起CPE的特点并未观察到明显不同。病毒感染SH-sy5y和MDCK细胞系后没有明显的CPE出现，但是在SH-sy5y细胞系中存在病毒的增殖，而MDCK细胞系为非敏感细胞系。G1、G3和G5型乙脑病毒在BHK-21、Vero和SH-sy5y细胞系中的增殖曲线没有明显差异；在C6/36和PK-15细胞系中，G1型乙脑病毒的滴度高于其他两型乙脑病毒；在DF-1细胞系中，G5型高于其他两者，在N2a细胞系中，G5型低于其他两者。结论:3种不同基因型别的乙脑病毒在不同细胞系中的增殖存在差异，可为针对乙脑病毒不同方向的研究提供选择参考。

目的:了解淡豆豉水煎液体外抗流感病毒作用，为抑制病毒的新型中药开发提供基础。方法:以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)（以下简称PR8病毒）感染狗肾上皮细胞(MDCK)作为模型，应用噻唑兰(MTT)法评估淡豆豉水煎液的安全性。以血液凝集抑制实验和神经氨酸酶活性抑制实验检测淡豆豉水煎液对流感病毒吸附和释放的影响。设立PR8病毒+淡豆豉水煎液组和PR8病毒组，以实时荧光定量PCR、Western印迹试验、免疫荧光的方法检测淡豆豉水煎液对病毒基因转录水平和蛋白表达水平的影响。结果:6.25 mg/mL的淡豆豉水煎液能够抑制1 HAU流感病毒的吸附。PR8+淡豆豉水煎液组的子代病毒血凝效价为PR8组的1/8。2 000 μg/mL的淡豆豉水煎液能够抑制大于80%的神经氨酸酶活性。在第24小时，PR8+淡豆豉水煎液组的NP和M1基因转录水平分别为3 444.52±378.35和98 737.80±1 643.00；NP、M1a和M2e蛋白表达水平分别为0.39±0.03、0.54±0.01和0.82±0.02，均低于PR8组( t=-16.03、-16.17、-39.26、-272.80和-220.00， P均<0.05)。 结论:淡豆豉水煎液通过影响流感病毒生命周期的吸附、基因转录和翻译、流感子代病毒释放多个阶段，在体外发挥直接抗流感病毒作用。

目的:对昆明市1株人感染H9N2禽流感病毒进行全基因组测定，分析病毒基因进化及氨基酸位点变异情况。方法:通过real-time RT-PCR方法对病例标本进行流感病毒分型检测，使用MDCK细胞进行病毒分离，应用Illumina Miseq高通量测序仪进行病毒全基因组序列测定，下机数据应用CLC Genomicsworkbench 8.0软件进行拼接，使用Mega 7.0软件对序列进行比对分析和进化树构建。结果:病例咽拭子标本检测结果显示甲型H9N2亚型阳性，通过分离培养收获H9N2毒株并进行全基因组序列测定，获得分离株全基因组序列。分离株8个基因片段相似度最高序列来源不完全一致，系统进化分析显示，HA、NA和PB2基因位于G9-like分支，M基因位于G1-like分支，NS1、PB1、PA、NP均位于F/98-like分支。HA基因受体结合位点表现为I155T、H183N、Q226L突变，M1基因上表现为N30D、T215A、V15I突变，M2、NS1、PB1基因上分别存在L55F、P42S、L13P突变，PA基因上存在K356R、S409N突变。结论:昆明分离株8个基因片段来源不一致，受体结合特性趋于优先结合人类受体，致病性有增强的趋势，后续应开展更多频次的主动监测及时发现病毒分布变化和变异情况。

目的:评价犬肾细胞基质四价流感裂解疫苗(MDCK-Va)配伍不同佐剂后的免疫原性。方法:将高、中、低剂量的MDCK-Va和鸡胚基质四价流感裂解疫苗(egg-Va)原液分别肌肉免疫BALB/c小鼠2次，间隔3周，小鼠眼静脉采血，分离血清，血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)试验检测抗体效价。不同剂量的MDCK-Va分别配伍QS21、AddVax、PolyI∶C、CpG ODN 1826以及AddVax/PolyI∶C(Add/Poly)联合佐剂，免疫小鼠，初次免疫21 d后，小鼠眼静脉采血，HI和微量中和(microneutralization，MN)试验检测抗体效价，同等剂量加强免疫21 d后，再次采血检测抗体效价。10 μg MDCK-Va配伍上述佐剂，加强免疫5 d后，取小鼠脾脏检测脾指数和脾细胞分型。结果:MDCK-Va诱导的各型别(H1N1、H3N2、B/Victoria和B/Yamagate)的血清效价均非劣效egg-Va诱导的血清效价。QS21/Va、AddVax/Va、PolyI∶C/Va、CpG ODN 1826/Va，以及Add/Poly/Va诱导的小鼠血清HI抗体效价均高于MDCK-Va，尤其是QS21/Va和Add/Poly/Va诱导的保护性效价，其差异具有统计学意义。对于H1N1疫苗，血清HI抗体和MN抗体之间的Pearson相关系数为0.737~0.910；对于H3N2亚型，HI抗体和MN抗体的Pearson相关系数为0.839~0.947。QS21/Va组具有明显的脾指数增高，但淋巴细胞占比降低。QS21/Va和Add/Poly/Va对小鼠脾脏中性粒细胞和CD4/CD8细胞的刺激明显强于其他佐剂。结论:Add/Poly/Va组对MDCK-Va具有较强的免疫增强作用，可作为MDCK-Va的候选佐剂。HI和MN试验检测的抗体具有很强的正相关性。

目的 在细胞水平观察桑藿排毒茶对甲型H1N1 流感病毒的抑制作用.方法 利用CCK-8 试剂检测桑藿排毒茶的细胞毒性,通过分析不同处理组中甲型流感病毒RNA与蛋白表达水平的变化,评价该组方抗甲型流感病毒活性的高低.结果 桑藿排毒茶与磷酸奥司他韦对犬肾细胞(MDCK)的最大无毒浓度(TC0)分别为4.32、1.02 mg·mL-1,半数有效浓度(EC50)分别为 0.38 mg·mL-1、3.5 μg·mL-1.在Q-PCR与Western blotting试验中,相较于病毒组,经药物处理后的感染细胞中流感病毒RNA与蛋白的表达量均显著降低,说明其对病毒的抑制作用较强.结论 桑藿排毒茶在细胞水平可以抵抗甲型流感病毒感染,具有进一步开发意义.

目的:探讨酒川芎(wine-processed Chuanxiong Rhizoma,WCR)联合吉非替尼或厄洛替尼治疗表皮生长因子受体(epider-mal growth factor receptor,EGFR)突变型非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)脑移植瘤的作用机制.方法:建立ABCB1-MDCK细胞和PC9 细胞共培养体系,采用流式细胞术检测WCR(2g·L-1)联合吉非替尼或厄洛替尼(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1)作用于PC9 细胞的凋亡情况.通过 ABCB1-MDCK 细胞单层转运模型评估 WCR(0.5g·L-1、1g·L-1、2g·L-1)联合吉非替尼或厄洛替尼(8 μmol·L-1)的跨膜转运情况,并计算表观渗透系数(Papp).体外培养ABCB1-MDCK细胞,采用透射电镜法、免疫荧光法(immunofluorescence,IF)和蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测超微结构和紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达水平.建立裸鼠NSCLC脑移植瘤模型,检测WCR联合吉非替尼或厄洛替尼对裸鼠脑内肿瘤生长、生存时间和药物含量的影响.结果:与单用吉非替尼或厄洛替尼比较,WCR联合吉非替尼或厄洛替尼可增加PC9 细胞的凋亡率(P<0.05).WCR联合吉非替尼或厄洛替尼的Papp(AP→BL)较吉非替尼或厄洛替尼增加(P<0.05),且与WCR浓度呈正相关.透射电镜结果显示,WCR可破坏ABCB1-MDCK细胞的紧密连接结构.IF和WB结果显示,WCR可降低ABCB1-MDCK细胞的ZO-1、P-gp表达水平(P<0.01).WCR联合吉非替尼或厄洛替尼可抑制脑内肿瘤生长、延长裸鼠生存时间并增加吉非替尼或厄洛替尼含量.结论:WCR联合吉非替尼或厄洛替尼可能通过促进细胞凋亡、改善药物转运以及下调ZO-1、P-gp表达水平,从而发挥治疗EGFR突变型NSCLC脑移植瘤的作用.

目的 评价H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在无血清悬浮培养MDCK细胞(sMDCK)中的传代稳定性.方法 将H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株工作种子批在sMDCK细胞中连续传15代.采用二代及一代测序法检测主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10和P15代病毒HA、NA、M、NP、NS、PA、PB1、PB2 8段基因核苷酸序列的稳定性;以肽段覆盖率为指标评价工作种子批、P5、P15代病毒主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白氨基酸序列的稳定性;选取工作种子批、P5和P15代病毒制备流感疫苗,经肌内免疫雌性BALB/c小鼠,每组10只,15 μg HA/只,28 d后加强免疫1次,剂量及给药途径同初次免疫,于初次免疫后28、42、56d,检测血清中和抗体效价,评价免疫原性的稳定性.结果 各代次流感病毒均未检测到片段插入或缺失,核苷酸序列与主种子批序列完全一致;主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10代病毒均未发生单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)突变,但P15代病毒多个基因位点存在SNP突变的可能性,其中杂合SNP数占91.62％.P5和P15代病毒的HA、NA蛋白肽段覆盖率为96.7％～100％.初次免疫后28、42、56 d,工作种子批、P5和P15代病毒免疫小鼠血清中和抗体效价差异均无统计学意义(H分别为2.253、2.029、1.408、P分别为0.324、0.363、0.495).结论 H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在sMDCK细胞中具有良好的遗传稳定性,有望应用于sMDCK细胞基质大流行流感疫苗的生产.

目的 优化不同亚型流感病毒在狗肾上皮细胞(MDCK)上最优培养条件,提高不同亚型流感病毒在MDCK细胞上的分离效果.方法 将甲型H1N1、H3 N2、Victoria、Yamagata四种亚型的流感病毒以不同的培养条件:不同培养温度、不同培养基、不同的牛血清浓度、不同L-1(对-甲苯磺酰)苯丙胺酰氯甲酮(rPCK)胰酶浓度、不同的接种量、不同的接种时间接种到MDCK细胞上,在24h、48h、72h、96h取培养物上清测血凝滴度,比较不同亚型流感病毒在MDCK细胞病变速度和病毒含量的差异.结果 甲型H1N1流感病毒的最优培养温度为35℃,DMEM培养基,无牛血清,TPCK胰酶浓度为1-3 μg/ml,接种300rml,不吸附或吸附1.5-3.0小时;H3 N2病毒的最优培养温度为34℃,DMEM培养基,无牛血清,TPCK胰酶浓度为1μg/ml,吸附1.5小时,接种300ml;Victoria流感病毒的最优培养温度为35℃,DMEM培养基,无牛血清,TPCK胰酶浓度为0.5-2.0μg/ml,接种200ml,吸附1.5小时;Yamagata流感病毒的最优培养温度为35℃,DMEM培养基,无牛血清,TPCK胰酶浓度为1μg/ml,接种200ml,吸附1.5小时.结论 根据流感病毒不同亚型来选择流感病毒的培养条件可获得更好的实验结果.