目的:探讨肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)在抗β 2GP1/β 2GP1复合物诱导中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成中的作用。 方法:分离健康人外周血中性粒细胞与抗β 2GP1/β 2GP1复合物(100 μg/ml)共孵育一定时间，Western blot检测细胞PAD4表达；进一步采用PAD4抑制剂Cl-amidine(10 μmol/L)预处理中性粒细胞，Western blot检测细胞瓜氨酸化组蛋白3(CitH3)蛋白质表达，ELISA检测细胞培养上清中髓过氧化物酶(MPO)-DNA相对含量。下腔静脉狭窄法建立APS小鼠血栓模型，并通过腹腔注射Cl-amidine(50 mg/kg)进行干预，Western blot检测血浆中CitH3蛋白质表达，荧光染色法检测血浆中循环游离DNA(cf-DNA)浓度，取下腔静脉血栓称其重量，观察Cl-amidine能否抑制APS-IgG诱导的NETs和血栓形成。组间差异采用 t检验或单因素方差分析。 结果:抗β 2GP1/β 2GP1复合物能够显著下调细胞质中PAD4蛋白质表达水平[(3.67±0.32) vs (1.47±0.19)， t＝10.22， P<0.05]，并使细胞核内PAD4蛋白质含量升高[(0.57±0.19) vs (2.97±0.31)， t＝11.49， P<0.05]；Cl-amidine能显著抑制抗β 2GP1/β 2GP1复合物诱导的中性粒细胞CitH3蛋白质表达[(2.46±0.47) vs (0.46±0.13)， t＝12.24， P<0.01]，明显减少培养上清中MPO-DNA含量[(4.09±0.94) vs (2.80±0.57)， t＝4.23， P<0.05]。在体内试验中，Cl-amidine能显著抑制APS小鼠血浆中CitH3蛋白质表达[(3.97±0.56) vs (1.09±0.45)， t＝11.83， P<0.01]，明显降低APS小鼠血浆中cf-DNA浓度[(2 685.0±735.8) vs (1 784.0±577.0)， t＝3.93， P<0.05]；与对照组EAPS小鼠相比，经Cl-amidine预处理的APS小鼠血栓形成明显减小[(8.22±3.06) vs (4.89±1.90)， t＝2.27， P<0.05]。 结论:PAD4参与了抗β 2GP1/β 2GP1复合物诱导的NETs形成，其可能在APS血栓形成中发挥重要作用。

目的 探究GSK484对强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)中性粒细胞胞外诱捕网(neu-trophil extracellular traps,NETs)形成和炎症反应的作用及其相关机制.方法 检测AS患者和健康受试者外周血PAD4、H3cit、IL-1β、IL-6水平和NETs形成差异.将30只Balb/c小鼠分为:对照组、模型组、GSK484给药组.模型组、GSK484给药组进行AS造模,GSK484给药组造模后连续一周灌胃4 mg/kg GSK484,其余组灌胃同体积生理盐水.结束后比较各组小鼠踝关节损伤评分,NETs水平和PAD4、H3cit、IL-6、IFN-γ水平.结果 与健康受试者比较,AS患者外周血PAD4、H3cit、IL-1β、IL-6水平升高,NETs形成和IL-1β、IL-6水平升高.与模型组比较,GSK484给药组小鼠踝关节损伤评分、NETs形成和PAD4、H3cit、IL-1β、IL-6水平降低.结论 GSK484可抑制NETs形成,为缓解AS炎症反应提供了新的治疗策略.

目的 探索脑型疟发病过程中,星形胶质细胞被脑血管周炎性微环境诱导活化及其机制,及其对神经元损伤的影响.方法 4～5周C57BU6雄性小鼠经腹腔接种5 × 106个感染伯氏疟原虫ANKA株的红细胞,7～10 d后死亡,作为实验型脑型疟模型.新生3～5d的乳鼠,安乐死后分离脑皮层原代星形胶质细胞;24h内的乳鼠,安乐死后分离脑皮层原代神经元.以20 ng/ml γ干扰素(IFN-γ)、1 ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)和感染疟原虫的小鼠红细胞(pRBC)诱导星形胶质细胞活化,作为活化组,同时设置未处理静息态细胞作为对照组.24 h后用细胞裂解提取液提取总RNA测序,聚类分析生成热图,选取代表性的数个基因绘制小提琴图.ELISA测定细胞培养上清中CXCL10表达水平.分离脑型疟小鼠脾脏CD8+T细胞,与活化的星形胶质细胞共孵育,荧光显微镜下观察免疫突触及与CXCL10抗体共孵育后的CXCL10水平,流式细胞仪检测CD80等分子表达水平.原代神经元加入两组星形胶质细胞培养上清,在MAP2抗体中孵育,设置空白培养基作为空白组,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测神经元损伤程度,CCK-8试剂盒检测神经元活力.Western blotting检测STAT1、STAT3及其磷酸化分子水平,活化组加入STAT1通路抑制剂氟达拉滨,免疫荧光染色观察神经元形态.采用PRISM Graph Pad 8.0软件进行统计学分析,两两比较采用t检验.结果 活化组星形胶质细胞形态由扁平星状变为长梭形,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)相对含量为(1.36±0.03),高于对照组的(1.00±0.00)(t=13.33,P＜0.01);活化组细胞培养上清中的CXCL10含量为(7.07±0.81)ng/ml,高于对照组的(2.57±0.28)ng/ml(t=9.05,P＜0.01).转录组分析显示,活化组抗原加工、提呈与T细胞趋化因子转录水平上调(均P＜0.01),CD80、CD86、MHC Ⅰ表达水平上调.活化组和CD8+T细胞共孵育形成"免疫突触",CD8+T细胞CD69表达量提高.LDH结果显示,活化组上清刺激后神经元相对死亡率为(50.2±2.4)％,高于空白组(0％)和对照组(0％)(t=20.62、20.62,均P＜0.01);CCK-8检测结果显示,活化组上清刺激后神经元相对活力为0.52±0.03,低于空白组(1.00±0.00)和对照组(1.42±0.06)(t=18.92、16.65,均P＜0.01);Western blotting结果显示,神经元经活化星形胶质细胞上清刺激后β-淀粉样前体蛋白(β-APP)相对表达量为0.44±0.02,低于空白组(1.00±0.00)和对照组(0.55±0.02)(t=37.28、4.93,均P＜0.01);促凋亡蛋白Bax与抑凋亡蛋白Bcl-2的比例为1.01±0.07,与空白组(1.00±0.00)、对照组(1.00±0.06)比较差异无统计学意义(t=0.31、0.13,均P＞0.05).Western blotting结果显示,活化组胞浆中STAT1、p-STATl蛋白相对表达量分别为3.40±1.08、4.00±0.82,均高于对照组(1)(t=3.13、5.13,均P＜0.05);活化组胞浆中STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量分别为1.00±0.03、1.01±0.05,与对照组(1)差异无统计学意义(t=0.27、0.52,均P＞0.05).在活化组胞核中p-STAT1蛋白相对表达量为1.78±0.21,高于对照组(1)(t=5.081,P＜0.01)、p-STAT3蛋白相对表达量为1.02±0.02,与对照组(1)差异无统计学意义(t=1.38,均P＞0.05).对MAP2免疫荧光染色结果显示,活化组上清可造成明显的神经元损伤,经STAT1抑制剂处理后损伤得到缓解.结论 脑型疟发病过程中血管周炎性微环境可通过STAT1分子诱导神经毒性星形胶质细胞产生,可导致神经元死亡.活化星形胶质细胞与活化的CD8+T细胞相互作用,进一步加重中枢神经系统损伤.

目的:探索鹿茸多肽通过基质细胞衍生因子(SDF-1α)/趋化因子受体(CXCR4)轴对磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(AKT)通路促进下肢动脉硬化性闭塞症(PAD)大鼠血管新生的作用机制.方法:采用结扎并离断大鼠股动脉及分支造成肢体缺血、给予高脂饲料喂养制作大鼠下肢动脉硬化闭塞症模型.将 100只雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为 10组,分别为空白组、模型组、假手术组,鹿茸多肽低剂量组、鹿茸多中剂量肽组、鹿茸多肽高剂量组、抑制剂 LY294002 组、鹿茸多肽低剂量+抑制剂LY294002组、鹿茸多肽中剂量+抑制剂LY294002组、鹿茸多肽高剂量+抑制剂LY294002组.将空白组、模型组及假手术组灌胃等容量蒸馏水.鹿茸多肽低、中、高剂量组+抑制剂LY294002组先行腹腔注射再灌胃,于造模完第 1天开始给药,每日 1次,28d后处死.采用流式细胞术检测给药后外周血、骨髓中造血干细胞(CD34+细胞)比例;免疫荧光法检测给药后患侧腓肠肌 SDF-1α、PI3K的阳性细胞数比例.结果:造血干细胞(CD34+细胞)比例模型组均显著高于空白组(P<0.05);其中鹿茸多肽低剂量组较鹿茸多肽低剂量+抑制剂 LY294002组阳性细胞比例升高,鹿茸多肽中剂量组较鹿茸多肽中剂量+抑制剂 LY294002 组阳性细胞比例升高,鹿茸多肽高剂量组较鹿茸多肽高剂量+抑制剂 LY294002组阳性细胞比例升高(P<0.05);给药组 SDF-1α、PI3K的阳性细胞数高于模型组及抑制组(P<0.05),鹿茸多肽中剂量组高于鹿茸多肽低剂量组(P<0.05),鹿茸多肽高剂量组高于鹿茸多肽高剂量组+ LY294002组(P<0.05).结论:鹿茸多肽通过 SDF-1α/CXCR4轴影响 PI3K/AKT信号通路促进了内皮祖细胞的增殖及分化、PAD血管新生.

目的 探究Cl-amidine对巨噬细胞M1型极化的影响以及其对强直性脊柱炎(AS)的临床指导意义.方法 选择60例AS患者,根据疾病活动度评分将患者分为低AS疾病组和高AS疾病组,同期纳入30例健康受试者作为对照组.EILSA检测三组人群血清PAD4、iNOS和骨形成指标BGP水平,皮尔逊相关系数分析肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)、一氧化氮合酶(iNOS)和骨钙素(BGP)的相关性;流式细胞术检测3组人群外周血M1型巨噬细胞(CD68+CD86+)比例.培养THP-1单核细胞系,体外诱导为M1型巨噬细胞,期间加入Cl-amidine共孵育,分组为:M0组、M1组、M1+Cl-amidine组,Western blot检测各组细胞PAD4和iNOS蛋白表达水平.RNA-seq检测M1组、M1+Cl-amidine组细胞差异表达基因并进行KEGG分析,Western blot检测JAK3、p-JAK3、STAT5、p-STAT5蛋白表达水平.结果 与对照组相比,低AS疾病组PAD4、iNOS水平升高,BGP水平降低,M1型巨噬细胞比例升高;与低AS疾病组相比,高AS疾病组PAD4、iNOS水平升高,BGP水平降低,M1型巨噬细胞比例升高.PAD4水平与iNOS水平呈正相关,PAD4、iNOS水平与BGP水平呈负相关.与MO组相比,M1组PAD4和iNOS蛋白表达升高;与M1组相比,M1+Cl-amidine组有163个基因表达上调,272个基因表达下调.上调基因主要参与JAK-STAT信号通路.与M1组相比,M1+Cl-amidine 组 iNOS、p-JAK3/JAK3、p-STAT5/STAT5 蛋白表达降低.结论 PAD4 和 M1 型巨噬细胞水平与AS疾病程度呈正相关.PAD4抑制剂Cl-amidine可能通过JAK3-STAT5信号通路抑制巨噬细胞向M1极化,该作用机制有助于AS临床治疗的研究.

目的 探讨精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)介导的瓜氨酸化组蛋白H3(H3cit)在脓毒症相关急性肾损伤(AKI)中的作用机制.方法 将30 只C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组和给药组,每组10 只.给药组连续7d灌胃PAD4 抑制剂BB-Cl-amidine,其余两组予同体积生理盐水.7 d后对模型组和给药组小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)构建AKI模型.24 h后处死小鼠,检测各组小鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、H3cit水平,尿液中尿微量白蛋白(UALb)/肌酐(Cr)比值水平,以及肾组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平,并分析SCr、BUN、UALb/Cr比值水平与H3cit水平的相关性.应用HE染色法检测各组小鼠肾脏损伤病理情况.采用Western blot法检测肾脏PAD4 和H3cit蛋白表达水平.采用HEK293T细胞进行实验,设置空白组、LPS组、LPS+BB-Cl-amidine组,通过Western blot法检测各组PAD4 和H3cit蛋白表达水平,通过CCK-8 法检测各组细胞增殖水平.结果 在动物实验中,与对照组比较,模型组小鼠血清SCr、BUN和H3cit水平升高,尿UALb/Cr比值升高,肾组织MDA水平升高、SOD水平降低,肾脏病理损伤加重,PAD4 和H3cit蛋白表达升高,差异有统计学意义(P＜0.05).与模型组比较,给药组小鼠血清中SCr、BUN和H3cit水平降低,尿UALb/Cr比值降低,肾组织MDA水平降低、SOD水平升高,肾脏病理损伤缓解,H3cit蛋白表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05).H3cit水平与SCr、BUN、UALb/Cr比值水平呈正相关(P＜0.05).在细胞实验中,与空白组比较,LPS组细胞PAD4 和H3cit蛋白表达升高,细胞增殖水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05).与LPS组比较,LPS+BB-Cl-amidine组细胞H3cit蛋白表达降低,细胞增殖水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PAD4 介导的H3cit可促进脓毒症相关AKI的发展,抑制PAD4 活性可以有效减少肾脏细胞损伤.

目的 探讨姜黄素对乳腺癌小鼠的抗肿瘤作用及其机制.方法 将4T1小鼠乳腺癌细胞接种于BALB/c小鼠乳腺脂肪垫下,建立乳腺癌小鼠模型.将成功建模的荷瘤小鼠随机分为模型组和姜黄素低、中、高剂量(25、50、100 mg/kg)组.连续给药4周后,计算抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;蛋白质印迹法(Western blot)检测肿瘤组织中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达及磷酸化水平.细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测PI3K激动剂胰岛素样生长因子(IGF-1)、抑制剂LY294002和姜黄素对小鼠乳腺癌细胞4T1的影响,并探讨IGF-1、LY294002和姜黄素对MCF-7细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响.应用SPSS 17.0统计软件分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本t检验.结果 姜黄素中、高剂量组肿瘤重量[(0.91±0.21)、(0.83±0.18)比(1.18±0.24)g,t =2.820,P＜0.05;t=3.846,P＜0.01]低于模型组,抑瘤率分别为22.88％和29.66％.姜黄素中、高剂量组脾脏指数[(7.14±0.85)、(7.58±0.89)比(6.32±0.57) mg/g,t=2.398,P＜0.05;t =3.628,P＜0.01]和高剂量组胸腺指数[(2.85±0.47)比(2.33±0.28) mg/g,t=3.254,P＜0.01]高于模型组.姜黄素中、高剂量组血清IL-2[(139.55±16.95)、(146.78±17.21)比(120.46±15.45) ng/L,t=2.819,P ＜0.05;t=3.859,P ＜0.01]、TNF-α[(53.46±6.89)、(57.19±7.01)比(46.57±6.32) ng/L,t=2.493,P＜0.05;t=3.811,P＜0.01]和高剂量组IL-12[(163.24±18.73)比(148.26±16.31) ng/L,t=2.340,P＜0.05]高于模型组.姜黄素中、高剂量组肿瘤组织中p-Akt水平(0.69±0.12、0.62±0.08比0.83±0.14,t=2.405,P＜0.05;t =4.161,P＜0.01)和高剂量组p-PI3K(0.62±0.11比0.75±0.13,t=2.537,P＜0.05)、p-mTOR(0.56±0.11比0.69±0.17,t =2.098,P＜0.05)水平低于模型组.IGF-1、LY294002和姜黄素(100 μmo]/L)干预4T1后,细胞存活率分别为211.40％、36.40％和63.93％(t=11.890,P＜0.01;t=16.160,P＜0.01;t=8.742,P＜0.01).与阴性对照组(0.671±0.082、0.633±0.065、0.583±0.042)比较,IGF-1组(0.942±0.081、0.894±0.093、0.831 ±0.065,t=5.257,P＜0.01;t=5.144,P＜0.01;t=7.166,P＜0.01)和IGF-1+姜黄素组p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平显著升高(0.759±0.061、0.751±0.058、0.682±0.047,t=2.801,P＜0.05;t=3.029,P＜0.05;t=3.512,P＜0.01).与IGF-1组比较,IGF-1+姜黄素组p-PI3K(t=3.153,P ＜0.05)、p-Akt(t=2.917,P＜0.05)和p-mTOR水平降低(t=4.154,P＜0.01).结论 姜黄素具有抑制小鼠乳腺癌的作用,并能够提高机体免疫能力,其抗肿瘤机制与抑制PI3 K/Akt/mTOR信号通路活化有关.

目的:研究树豆酮酸A对人肝微粒体中的5种细胞色素P450(CYP)酶的体外抑制作用.方法:采用Cocktail探针药物法,在人肝微粒体中加入50.0、15.0、5.0、1.5、0.5、0.15、0.05μmol/L的树豆酮酸A,与混合探针药物[包含非那西丁、右美沙芬、奥美拉唑、睾酮、甲苯磺丁脲(分别为CYP1A2、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9的探针药物)]共同孵育60 min.在另设空白组和阳性对照组[α-萘黄铜、奎尼丁、(+)-N-3-苄基香酚、酮康唑、磺胺苯吡唑(分别为CYP1A2、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9的特异性抑制剂)]的基础上,以葛根素为内标,采用超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS/MS)分析相应代谢产物(对乙酰氨基酚、右啡烷、5-羟基奥美拉唑、6β-羟基睾酮、羟基甲苯磺丁脲)的含量.以ACQUITY UPLC?BEH C18为色谱柱,以0.01％甲酸水溶液-0.01％甲酸乙腈为流动相(梯度洗脱),柱温为40℃,流速为0.4 mL/min,进样量为2μL;采用电喷雾电离源,以多反应监测模式进行正负离子扫描,数据采集范围为m/z 100～1200,碰撞气为氩气,雾化气为氮气,锥孔气流量为50 L/h,脱溶剂气流量为800 L/h,正、负离子模式下毛细管电压分别为2.0、1.5 kV,离子源温度分别为120、110℃,脱溶剂的温度分别为400、450℃.使用Graph-pad Prism 5.0软件进行非线性回归分析并计算半数抑制浓度(IC50).结果:上述各代谢产物检测浓度的线性范围分别为0.26～8.35、0.36～34.56、0.10～3.09、3.67～117.37、0.15～4.88μmol/L(R2>0.99),定量下限分别为0.26、0.36、0.10、3.67、0.15μmol/L.阳性对照组特异性抑制剂对人肝微粒体中CYP1A2、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9酶的IC50均在文献报道的可接受范围内.树豆酮酸A对人肝微粒体中CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4酶的IC50值均大于50μmol/L,对CYP2C9、CYP2C19酶的IC50值分别为4.94、18.00μmol/L.结论:树豆酮酸A对人肝微粒体中CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4酶没有抑制作用,对CYP2C9、CYP2C19酶有一定的抑制作用.

目的:分析类风湿关节炎(RA)患者肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)蛋白的表达水平与类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体及28个关节的疾病活动度评分(DAS28)的相关性,探讨PAD4对RA的诊断和治疗价值.方法:收集90例RA患者和76例健康对照者的血清,同时收集RA患者的临床资料,ELISA法检测PAD4的表达水平及RA患者血清中抗CCP抗体、RF-IgA、RF-IgG的表达水平.收集39例RA患者和22例健康对照者EDTA抗凝全血,采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC),实时荧光定量PCR检测PAD4 mRNA的表达水平;特种蛋白仪检测89例RA患者血清中RF-IgM的水平.分离并培养RA患者PBMC,分别加入7.5、15、30、60μmol·L-1 PAD4抑制剂F-amidine,作用24、48及72 h后CCK-8检测PBMC增殖情况并确定最佳浓度和最佳作用时间;在最佳浓度和最佳作用时间时收集细胞采用流式细胞术检测PBMC细胞凋亡情况.结果:RA患者血清中PAD4的浓度为(5.94±0.37)ng·ml-1,显著高于健康对照者的(2.30±0.18)ng·ml-1,差异有统计学意义(P<0.05).PAD4诊断RA的ROC曲线下面积(AUC)为0.875.RA患者PAD4的表达水平与RF-IgM呈正相关(r=0.22,P=0.039),抗CCP抗体阳性组患者PAD4的表达水平与抗CCP抗体水平呈正相关(r=0.258,P=0.033),而抗CCP抗体阴性组患者血清中也会有高水平的PAD4表达;PAD4表达水平与RF-IgA、RF-IgG和DAS28无相关性.PAD4抑制剂F-amidine作用RA患者PBMC的最佳作用时间是48 h,最佳作用浓度是15μmol·L-1.F-amidine可以增加PBMC晚期凋亡比例.RA患者全血中PAD4 mRNA的表达水平为7.23±9.57,显著高于健康对照者的1.00±0.00,差异有统计学意义(P<0.05),同时PAD4 mRNA的表达水平与抗CCP抗体呈正相关(r=0.390,P=0.023),但与RF及DAS28无相关性.结论:RA患者PAD4的表达水平可作为诊断RA的一个指标,在抗CCP抗体阴性的RA患者中也有73.7％的表达PAD4,检测PAD4的水平对其诊断价值更高;PAD4可以作为治疗RA的一个靶点.

肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(peptidylarginine deiminase 4,PAD4)依赖钙离子催化精氨酸残基向目标蛋白瓜氨酸残基转化的过程,是一种翻译后修饰,被称为瓜氨酸化.PAD4通过组蛋白瓜氨酸化调节基因转录活性诱导人类疾病的发生、发展.综述了PAD4在自身免疫性疾病、肿瘤、急性冠状动脉综合征中的作用,总结了PAD4抑制剂介导蛋白质瓜氨酸化的生物学作用的可能机制,归纳了PAD4特异性抑制剂治疗类风湿关节炎和其他疾病的临床效用,讨论了PAD4及其抑制剂对自身免疫性疾病和癌症的潜在治疗价值.