目的:探讨冠状病毒感染所致心力衰竭（心衰）的机制，并预测对其可能有效的药物。方法:在基因表达数据库（GEO）检索冠状病毒和心衰，并筛选符合实验要求的组学数据。采用R语言Limma程序包进行差异表达基因分析，筛选差异表达基因。将两组差异基因导入R语言clusterProfiler包进行基因本体学（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，取两组结果的交集。采用STRING数据库对所有差异表达基因构建蛋白质互作网络并筛选核心基因。最后采用团队自主研发的表观精准治疗预测平台EpiMed预测冠状病毒所致心衰的治疗药物。结果:在GEO数据库检索并筛选得到GSE59185冠状病毒数据集，根据不同的亚型分为wt组、?E组、?3组、?5组、对照组5组样本，差异分析发现各亚组交集上调基因191?个，下调基因18?个。在GEO数据库检索并筛选得到GSE126062心衰数据集，共筛选差异表达基因495?个，其中上调165?个，下调330?个。冠状病毒与心衰差异表达基因富集分析，取交集处理共有GO条目20条，主要富集在病毒反应、病毒防御反应、Ⅰ型干扰素反应、γ干扰素调节、先天免疫反应调节、病毒生命周期负调控、病毒基因组复制调控等；共有5条KEGG通路，主要与肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、白细胞介素（IL）-17信号通路、细胞因子与受体相互作用、Toll样受体信号通路、人类巨细胞病毒感染有关。蛋白互作网络分析筛选出信号传导及转录激活蛋白3、IL-10、IL-17、TNF、干扰素调节因子9、2′, 5′-寡腺苷酸合成酶1、丝裂原活化蛋白激酶3、S-腺苷甲硫氨酸基区域蛋白2、CXC趋化因子配体10、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3共10?个核心基因。EpiMed平台预测可能对冠状病毒所致心衰有效的药物为TNF-α抑制剂、白藜醇、利托那韦、白芍、维甲酸、连翘、鱼腥草等。结论:多个炎症通路的异常活化可能是冠状病毒感染所致心衰的原因，白藜芦醇、利托那韦、维甲酸、白芍、连翘、鱼腥草可能对其具有治疗作用。

甲钴胺(MeCbl)黾哺乳动物细胞内的内源性维生素B12,其作为甲硫氨酸合成酶(MS)的辅酶,参与甲硫氨酸(Met)和内源性甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的合成,是一碳单位代谢的关键组分.SAM参与多种大分子物质的甲基化反应如DNA、RNA、蛋白质,是表观遗传调控的重要组分.因此,MeCbl对于甲基供体化合物的形成、基因表达、蛋白质活性和基因组稳定性的维持具有重要作用.本文就MeCbl代谢相关酶与蛋白质的遗传突变或多态性及其对基因组稳定性的研究进展进行简要综述.

目的 评价Hcy代谢相关基因S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因(AHCY)、胱硫醚β合成酶基因(CBS)甲基化与脑梗死之间有无相关关系.方法 应用荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)检测研究对象外周血中AHCY、CBS基因甲基化水平,并分析其与脑梗死的相关关系.结果 (1)病例组AHCY甲基化水平为0.16％(0.07％,0.32％),对照组为0.25％(0.02％,0.67％),差异无统计学意义(P=0.115,Z=-1.577).(2)病例组CBS甲基化水平70.20％(49.19％,94.87％),对照组为104.10％(74.65％,132.30％),差异有统计学意义(P=3.71E-10,Z=-6.266).按性别、年龄进行亚组分析,CBS基因甲基化水平均低于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05).结论 AHCY基因甲基化与脑梗死发病不相关,而CBS基因低甲基化与脑梗死的发病相关.

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶,在植物响应生物与非生物胁迫中发挥着重要作用.本研究根据白木香转录组高通量测序结果结合RACE、RT-PCR技术从白木香愈伤组织中首次克隆得到1个SAMS基因,命名为AsSAMS1,并对其进行生物学信息分析、原核表达与纯化、组织特异性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析.白木香AsSAMS1基因的开放阅读框(ORF)长1183 bp,编码393个氨基酸,其蛋白分子质量是43.13 kDa.生物学信息分析表明AsSAMS1蛋白含有3个SAMS的特征序列,系统进化树显示AsSAMS1蛋白与野大豆(Glycine soja) SAMS蛋白具有较高的同源性.构建原核表达载体pET28a-AsSAMS1并在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中成功表达AsSAMS1重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱纯化得到可溶性AsSAMS1重组蛋白.实时荧光定量PCR检测结果表明AsSAMS1基因在茎中表达最高,叶和茎尖次之,在根中表达最低.盐、干旱、低温以及重金属胁迫均能够提高AsSAMS1的表达量和其产物S-腺苷甲硫氨酸的含量;茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸、赤霉素也能够诱导白木香愈伤组织中AsSAMS1基因表达.本研究可以为进一步研究S-腺苷甲硫氨酸合成酶在白木香结香机制和植物防御反应中的作用奠定基础.

本研究利用TMT标记+LC-MS/MS技术来探明黄独低温离体保存微型块茎的差异蛋白.研究表明,所有肽段的mass error进行统计,大多数mass error ＜0.02 Da,且其分布均在0附近,MS数据比较精确,符合检测要求.大多数肽段的长度分布在8～16之间,符合tryptic酶切肽段的理论值,表明样本的前处理也符合要求.差异蛋白为106个,其中上调差异蛋白61个,下调差异蛋白45个.排名前10位差异蛋白分别为伸长因子3、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、蔗糖合成酶、光系统Ⅱ的贮藏蛋白质、未知蛋白、分子伴侣DNAK、α-淀粉酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和淀粉磷酸化酶,其中伸长因子3、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、蔗糖合成酶、分子伴侣DNAK和S-腺苷甲硫氨酸合成酶为在4℃低温离体保存中上调的蛋白,而未知蛋白、α-淀粉酶、淀粉磷酸化酶为在4℃低温离体保存中下调的蛋白.经过wego分析后,所有检测到的蛋白主要聚集于代谢过程、细胞过程细胞、绑定、催化等GO terms.通过富集,晚期内体膜、钙离子结合、谷胱甘肽转移酶活性、蛋白定位到液泡、高尔基液泡运输、液泡运输、氨基末端肽结合空泡分选和披网格蛋白小泡膜等GO term富集显著.富集的KEGG pathway主要有乙醛酸盐代谢、光合作用、甲烷代谢、碳水化合物的消化和吸收、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢和碳代谢.黄独低温离体保存微型块茎差异蛋白的初步发现为进一步了解其低温离体保存的分子机制奠定了基础,也为低温离体保存黄独微型块茎的破除休眠以及其后续萌发提供了理论依据.

通过对刚毛柽柳转录组分析,克隆获得了一条与S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因同源性高的基因,命名为ThSAMS.序列分析结果表明:ThSASM基因全长cDNA为1185 bp,编码394个氨基酸,编码蛋白相对分子质量为97.85 kDa,理论等电点为5.02.通过生物信息学分析表明,ThSASM基因编码的氨基酸与其他物种SAMS基因编码的氨基酸具有很高的同源性,其中与枣的同源性最高,达95％.实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析表明,ThSASM表达受NaCl、聚乙二醇(PEG)和ABA处理做出应答,暗示ThSASM可能参与了刚毛柽柳对盐和干旱的胁迫应答,为进一步研究SAMS基因在植物胁迫应答中的功能及作用机制提供了参考依据.

目的 探讨支链氨基酸与酰胺类氨基酸对胱硫醚-β-合成酶活性的影响.方法 40只Wistar大鼠随机分为10％酪蛋白(10C)对照组,10C+0.75％L-蛋氨酸+0.15％L-苏氨酸(10CMT)组,10CMT+ 12％支链氨基酸(10CMT+BCAA)组,10CMT+12％酰胺类氨基酸(10CMT+AmideAA)组,10CMT+12％支链氨基酸+12％酰胺类氨基酸(10CMT+BCAA+AmideAA)组.实验饲料喂养10d后处死动物,采集血液、肝脏样品,用于测定血液同型半胱氨酸以及肝脏中蛋氨酸代谢物和相应的酶学以及mRNA指标.结果 蛋氨酸的添加使血浆同型半胱氨酸的浓度显著升高,而支链氨基酸与酰胺类氨基酸的添加明显抑制了由蛋氨酸的摄入导致的高同型半胱氨酸血症的发生(P＜0.05),10CMT+BCAA+AmideAA组同型半胱氨酸水平接近10C组的水平.10CMT+BCAA+AmideAA组明显的降低了血中葡萄糖的水平(P＜0.05),10CMT+BCAA组显著增加了血中胰岛素的浓度(P＜0.05).与10C组比较,各氨基酸添加组均显著增加了肝脏S-腺苷甲硫氨酸(SAM)浓度(P＜0.05).10CMT、10CMT+BCAA、10CMT+AmideAA、10CMT+ BCAA+AmideAA组的肝脏胱硫醚-β-合成酶(CBS)活性均明显升高(P＜0.05),10CMT+BCAA组效果强于10CMT+AmideAA组,10CMT+BCAA+AmideAA组升高幅度最大.结论 高膳食蛋白引起的胱硫醚-β-合成酶活性增强可能与膳食蛋白中支链氨基酸与酰胺类氨基酸有关.

为降低S-腺苷甲硫氨酸的生产成本,构建了同时表达腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶3种酶的重组大肠杆菌菌株用于ATP的合成,并对ATP的转化条件进行了优化,优化后的反应体系为:腺苷30 mmol/L,乙酰磷酸二锂盐135 mmol/L,硫酸镁5 mmol/L,硼砂50 mmol/L,菌体2 g/L(湿重),反应液初始pH7.5,反应温度为35℃,反应时间为3 h,反应转化率可以达到99％ 以上.按照上述反应体系进行5 L放大,反应结束后再投入65 mmol/L D,L-甲硫氨酸和50 g/L(湿重)表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌体,并补加15 mmol/L硫酸镁,转化18 h S-腺苷甲硫酸浓度能达到8.7 g/L,转化率达到72.5％.

目的 探讨糖原合成激酶3β(GSK3β)的活性在肝细胞生长因子(HGF)信号通路中对改善心肌缺血再灌注损伤的作用及机制.方法 研究大鼠离体心肌细胞H9c2,用不同类型的GSK3β腺病毒[不表达GSK3β的重组腺病毒Ad-GFP;野生型GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-wt;表达GSK3β不可磷酸化的组成型活性突变体,其第9位丝氨酸残基突变(Ser9)为丙氨酸,从而不能再被磷酸化失活而具有固有活性的GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-S9A;表达催化失活的GSK3β复制缺陷型腺病毒载体,其第85位赖氨酸残基突变为甲硫氨酸,从而持续失活的GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-K85A]感染细胞和HGF激活剂刺激细胞,分为对照组、缺血再灌注(I/R)组、I/R+ HGF组、I/R+ HGF+ Ad-GFP组、I/R+ HGF+ GSK3β-Ad-wt组、I/R+ HGF+ GSK3β-Ad-S9A组和I/R+ HGF+GSK3β-Ad-K85A组.Western blot检测GSK3β,下游通路蛋白肝激酶B1(LKB1),腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMPK),自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ及上游通路蛋白激酶B(Akt)的表达水平.结果 与对照组和I/R组比较,HGF激活剂能促进pGSK3β,下游通路蛋白LKB1、AMPK,自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1,上游蛋白pAkt的表达,差异有统计学意义(P＜0.05);而在HGF激活剂的作用下,GSK3β的失活(Adwt和Ad-K85A腺病毒感染组)使下游通路蛋白LKB1、AMPK和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表达量明显升高,而在I/R+ HGF+ GSK3β-Ad-S9A组则明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 HGF通路通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3 K)/Akt/GSK3β/AMPK信号通路促进细胞自噬并改善心肌细胞缺血再灌注损伤.

目的 建立同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)致神经管畸形(neural tube defect,NTD)的小鼠模型,并探讨其作用机制.方法 以单独使用同型半胱氨酸硫代内酯(homocysteine thiolactone,HTL)及联合胱硫醚-β-合成酶(cystathio-nine-β-synthase,CBS)抑制剂氨基氧乙酸(aminooxyacetic acid,AOAA)建立小鼠NTD模型,其中单独使用HTL的剂量为 100、300、500、700mg/(kg·d),联用组中 HTL 的剂量为400、500、600 mg/(kg·d),AOAA 剂量均为30 mg/(kg·d),于小鼠孕6.5～10.5 d连续给药,均经腹腔注射.选择最佳剂量建立NTD 小鼠模型(NTD 组),同时设正常对照组.ELISA法检测孕鼠血液中Hcy水平及胚胎脑组织中S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)和S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)水平,Click-iT EdU 成像试剂盒检测小鼠胚胎神经上皮细胞的增殖情况,Western blot法检测胚胎脑组织中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达水平.结果 建立NTD的小鼠模型最佳方案为500 mg/(kg-d)HTL+30 mg/(kg-d)AOAA,该条件下NTD发生率最高,死亡率较低.与正常对照组比较,NTD组Hcy、SAH和SAM含量均显著升高(P＜0.01),SAM/SAH比值明显下降(P＜0.01);胚胎神经上皮细胞增殖受到显著抑制(P＜0.05);PCNA的表达水平显著下降(P＜0.05).结论 联合使用HTL与AOAA 成功建立了小鼠的NTD模型,抑制细胞增殖可能是导致NTD 发生的重要机制.