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siRNA沉默DJ-1通过PTEN/Akt通路对人胃癌细胞影响机制
编辑人员丨5天前
目的 探讨siRNA沉默DJ-1基因体内外对人胃癌MGC803细胞的影响机制.方法 构建沉默DJ-1基因MGC803细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆、细胞划痕和侵袭实验检测沉默DJ-1基因对MGC803细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测DJ-1、PTEN、Akt、p-Akt、Snail、Vimentin、E-cadherin、基质金属蛋白酶9(MMP-9)与基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)的表达;相差显微镜观察DJ-1沉默对MGC803细胞形态学的影响;裸鼠实验检测DJ-1沉默对MGC803细胞移植瘤的影响.结果 分别用4组si-DJ-1及si-NC质粒转染MGC803细胞,其中si-DJ-1A组DJ-1 mRNA与蛋白表达下调较为显著(P<0.001),则后续选用si-DJ-1A作为稳定沉默DJ-1基因MGC803细胞.MTT法检测结果显示,24、48和72 h后,si-DJ-1组增殖活性分别较MGC803对照组和si-NC组降低,均P<0.001.克隆形成实验显示,si-DJ-1组克隆形成数较对照组与si-NC组减少,P<0.001.划痕实验结果显示,si-DJ-1组迁移距离[(199.21±14.74)μm]较对照组[(302.62±17.70)μm]和si-NC组[(304.49+13.55)μm]缩短,P<0.001.侵袭实验显示,si-DJ-1组侵袭细胞数[(44.80±5.10)个]较对照组[(83.80±5.80)个]和 si-NC 组[(82.80±5.80)个]减少,P<0.001.与对照组和 si-NC 组相比,si-DJ-1 组 DJ-1 mRNA(F=18.350,P=0.003)、Snail mRNA(F=26.320,P<0.001)、Vimentin mRNA(F=44.379,P<0.001)与 MMP-9 mRNA(F=57.450,P<0.001)下调,而 E-cadherin mRNA(F=94.529,P<0.001)与 TIMP3 mRNA(F=16.480,P=0.004)上调;si-DJ-1 组 DJ-1(F=6.393,P=0.004)、p-Akt(F=12.980,P=0.007)、Snail(F=381.000,P<0.001)、Vimentin(F=99.750,P<0.001)与 MMP-9(F=126.800,P<0.001)蛋白下调,而 PTEN(F=36.880,P<0.001)、E-cadherin(F=181.000,P<0.001)与TIMP3(F=217.800,P<0.001)上调.相差显微镜显示,si-DJ-1组纤维母细胞样长梭形细胞肿瘤干细胞减少,圆形与椭圆形细胞增多,异型性下降.体内实验表明,si-DJ-1组移植瘤生长速度较对照组减慢,si-DJ-1 组移植瘤质量[(0.51±0.05)g]较对照组[(0.90±0.16)g]减小,t=5.273,P<0.001.si-DJ-1 组较对照组 DJ-1、Ki-67、Vimentin和CD-34阳性表达降低,而PTEN和E-cadherin表达增强.结论 DJ-1沉默可通过PTEN/Akt通路体内外抑制MGC803细胞增殖、迁移、侵袭与上皮细胞-间充质转化.
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编辑人员丨5天前
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基于B7/CD28/CTLA-4通路研究祖师麻及其炮制品对CIA大鼠的免疫作用机制
编辑人员丨5天前
研究祖师麻及其炮制品对SD大鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)中辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)分化的影响.按体质量将64只SD大鼠随机分为正常组,模型组,祖师麻炙品低、高剂量组,生品低、高剂量组,祖师麻甲素组,雷公藤多苷组.除正常组外,CIA模型在第1次免疫后第7天进行二免,并在二免7 d后灌胃28 d.取材后,采用苏木素-伊红(HE)染色观察CIA大鼠关节滑膜炎症的情况;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中转化生长因子-β(TGF-β)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10水平变化;实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测关节滑膜中分化簇80(B7-1)、分化簇86(B7-2)、分化簇28(CD28)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)mRNA和蛋白表达;流式细胞术用于检测大鼠关节滑膜中Th17和Treg细胞的比例.结果显示,与正常组相比,模型组大鼠的关节滑膜炎症明显加剧,关节炎指数评分明显上升,免疫器官指数上升(P<0.01);与模型组相比,各给药组均能不同程度地改善大鼠的关节炎症,降低关节评分指数,抑制滑膜增生,降低免疫器官指数;相较于模型组,各给药组中大鼠血清中IL-2、IFN-γ 显著下降(P<0.01),TGF-β、IL-4、IL-10 显著上升(P<0.01),滑膜中 B7-1、CTLA-4 mRNA 及蛋白表达显著升高(P<0.01),关节组织中的Th17细胞和Treg细胞的比例出现显著降低(P<0.01).综上得出祖师麻通过调控B7/CD28/CTLA-4通路以及调节Th17/Treg平衡,抑制CIA大鼠中Th17细胞的表达,促进Treg细胞的表达,进而治疗RA.
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编辑人员丨5天前
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KRAS抑制剂AMG510联合放疗激活肺癌免疫动物模型研究
编辑人员丨5天前
目的 探讨AMG510与放疗联合能否通过提高抗肿瘤免疫增加疗效.方法 体外使用细胞计数试剂盒8(CCK8)检测小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)对AMG510的敏感性,并对LLC进行RAS基因测序.使用C57BL/6小鼠构建移植瘤模型,随机分为4组[对照组、放疗(RT)组、AMG510组和AMG510+RT组],分别接受AMG510和(或)放疗的治疗方式,观察抑制肿瘤生长的情况.通过流式细胞仪及免疫组化的方法检测肿瘤浸润T淋巴细胞的情况.对治疗后的肿瘤进行基因表达测序,使用热图及信号通路富集等方法分析免疫相关基因表达变化.组间比较采用单因素方差分析或非参数检验中的中位数检验.结果 LLC细胞同时具有KRAS G12C和NRAS Q61H位点突变.CCK8结果显示,AMG510单药对LLC生长抑制至63%.体内实验结果显示,AMG510单药控制肿瘤生长作用有限,但联合放疗后肿瘤生长体积受到明显控制,优于任何单一治疗(均P<0.05).流式细胞术结果显示,AMG510+RT组的肿瘤浸润CD3+T、CD4+T 和 CD8+T 细胞的比例为 3.29%(2.81%,6.44%)、1.04%(0.72%,2.43%)和 2.16%(0.93%,4.19%),相较于其他3组浸润增加,均P<0.05;免疫组化结果显示趋势与流式细胞术一致.免疫组化结果显示,AMG510+RT组与对照组和RT组相比,能够增加干扰素(IFN)-γ+T细胞的浸润(均P=0.009),但调节性T细胞(Treg)及巨噬细胞浸润数量4组间差异无统计学意义,x2值分别为2.22和0.50,P值分别为0.528和0.918.基因测序分析显示,AMG510联合放疗对比对照组差异基因数据最多,包括399个上调和46个下调的基因,免疫相关基因表达上调.AMG510联合放疗及AMG510单药均能够增强趋化因子信号通路及T细胞受体信号通路.结论 AMG510与放疗联合能够显著抑制KRAS G12C突变肺癌生长,提高T细胞相关的肿瘤免疫,具有一定转化医学意义.
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编辑人员丨5天前
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利伐沙班联合氯吡格雷对脑梗死合并房颤患者的治疗效果
编辑人员丨5天前
目的 研究利伐沙班联合氯吡格雷对脑梗死合并房颤患者的治疗效果.方法 选择2021年7月至2022年7月衡水市第六人民医院收治的脑梗死合并房颤96例患者随机分为华法林组(48例)和联合组(48例).华法林组采用华法林钠片进行治疗,联合组采用利伐沙班片联合硫酸氢氯吡格雷片进行治疗,两组治疗6个月.统计两组临床疗效、安全性,比较两组血清细胞因子、炎症反应指标水平、外周血免疫指标水平及凝血功能、神经功能、生活能力.结果 治疗6个月后,联合组总有效率高于华法林组,差异有统计学意义(x2=4.098,P<0.05).治疗6个月后,联合组外周血CD8+及血清内皮素-1(ET-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、降钙素原(PCT)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、D-二聚体(D-D)水平低于华法林组,差异有统计学意义(t=4.019、8.809、4.598、15.340、6.175、13.846、15.006);联合组美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、改良Rankin评分(mRS)评分低于华法林组,差异有统计学意义(t=5.304、8.660);外周血CD4+、血清血小板衍生生长因子(PDGFs)、血管内皮生长因子(VEGF)水平、凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、Barthel指数(BI)评分高于华法林组,差异有统计学意义(t=4.265、5.914、18.960、13.204、4.578、8.762,P<0.05).治疗期间,两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义,差异有统计学意义(x2=0.000,P=1.000).结论 与华法林钠片相比,利伐沙班片联合硫酸氢氯吡格雷片治疗脑梗死合并房颤患者的临床疗效更好,且安全性良好.
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编辑人员丨5天前
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IL-27的生物学特性及其在肿瘤免疫中的研究进展
编辑人员丨5天前
白细胞介素(interleukin,IL)-27是由IL-27p28和EBI3亚基结合而成的一种异源二聚体型细胞因子,属于IL-6和IL-12细胞因子家族成员。IL-27主要来源于抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APC),参与调节固有免疫和适应性免疫应答。研究发现IL-27主要发挥免疫增强作用,调控辅助性T细胞(helper T cell,Th)1分化,增强CD4 +T细胞和CD8 +T细胞免疫活性或直接抑制肿瘤生长。文章从IL-27结构、生物学功能和信号通路出发,总结IL-27的抗肿瘤机制及其在癌症研究中的新进展。
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编辑人员丨5天前
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1型糖尿病小鼠肠道菌群与免疫状态演变的实验研究
编辑人员丨5天前
目的:探究链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病(T1DM)小鼠在不同时期的肠道功能、血清相关抗体、脾脏细胞因子谱表达与肠道菌群的演变。方法:取3~4周龄雄性C57BL/6小鼠28只,采用随机抽样法分为对照组(NC组,13只)和STZ组(15只)。STZ组连续5 d空腹腹腔注射STZ 50 mg·kg -1·d -1,NC组注射等体积溶剂。实验第3周测定随机血糖>16.7 mmol/L为建模成功,定义为基线水平,两组各取6只小鼠处死,剩余小鼠观察4周,即实验第7周(实验终点)处死剩余小鼠。每周测量体重、随机血糖和每日饮水量。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测脾脏细胞因子谱[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-6、IL-17、IL-4、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)]、血清相关抗体[胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛素自身抗体(IAA)与谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)]和结肠紧密连接蛋白1(ZO-1)的表达;采用流式细胞术检测脾脏CD4 +FoxP3 +调节性T细胞(Treg)水平;对粪便进行16SrRNA菌群测序分析。组间比较采用独立样本 t检验。采用Spearman相关分析法分析CD4 +FoxP3 +Treg细胞、肠道菌群、各免疫生化指标之间的相关性。 结果:流式细胞术与ELISA结果显示,在基线水平,与NC组相比,STZ组小鼠脾脏CD4 +FoxP3 +Treg、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17与血清ICA、IAA表达水平增加,脾脏IL-4、IL-10表达水平下降(均 P<0.05);在实验终点,与NC组相比,STZ组小鼠脾脏TNF-α、IFN-γ、IL-6,血清GADA、ICA与结肠ZO-1表达水平增加(均 P<0.05)。16SrRNA测序结果显示,与NC组相比,STZ组乳杆菌属丰度明显下降( P<0.05),拟杆菌属、阿克曼菌属、普雷沃菌属和颤螺菌属丰度明显上升(均 P<0.05)。Spearman相关性分析结果表明,乳杆菌属丰度与IL-10水平呈正相关( r=0.65, P<0.05),与TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17和GADA水平呈负相关( r值-0.61~-0.58,均 P<0.05);颤螺菌属丰度与TGF-β、TNF-α、IL-6和IAA水平呈正相关( r值0.55~0.72,均 P<0.05),与IL-10水平呈负相关( r=-0.59, P<0.05)。 结论:多次低剂量STZ诱导的T1DM小鼠可能存在CD4 +Foxp3 +Treg及TGF-β介导的负性免疫调节和以增加结肠ZO-1表达的肠道调节,其中颤螺菌属与乳杆菌属丰度改变可能参与免疫调节。
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编辑人员丨5天前
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微小RNA-19a-3p调控核因子激活的B细胞的κ-轻链增强通路介导乳腺癌细胞微环境影响血管内皮细胞生长
编辑人员丨5天前
目的:构建共培养模型模拟乳腺癌的体内微环境,探讨微小RNA(miR)-19a-3p调控核因子-κB(NF-κB)通路介导乳腺癌细胞微环境影响肺血管内皮细胞表型的机制。方法:细胞计数试剂盒(CCK-8)检测筛选吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)(NF-κB信号通路的抑制剂)干预4T1细胞最佳浓度,构建4T1小鼠乳腺癌肺高转移细胞和小鼠肺微血管内皮细胞共培养模型,构建并转染miR-19a-3p mimics、NC,将细胞分为对照组、模型组、mimics-NC组、mimics组、mimics-NC+PDTC组、mimics+PDTC组,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组4T1细胞的miR-19a、NF-κB p65基因水平的表达,蛋白质印迹法(Western blot)法检测各组4T1细胞NF-κB p65及磷酸化蛋白水平的表达,CCK-8法检测各组MPVECs增殖能力,流式细胞术检测各组MPVECs凋亡,免疫荧光检测各组MPVECs中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达。两组间比较采用非配对 t检验,组间比较采用单因素方差分析。 结果:PDTC最佳作用浓度为80 mol/L,模型组细胞增殖活力高于对照组(1.67±0.02比1.26±0.04, F=268.8, P<0.01),凋亡率和miR-19a-3p mRNA表达低于对照组[(4.96±0.03)%比(12.26±0.05)%,mRNA相对值:0.22±0.02比1.00±0.05, F=141.3、392.6, P<0.01],NF-κB p65的mRNA和蛋白表达高于对照组(mRNA相对值:3.80±0.07比1.00±0.04,灰度值比值:0.69±0.05比0.13±0.02, F=221.6、206.3, P<0.01),VEGF蛋白表达高于对照组(平均吸光度值:0.44±0.03比0.13±0.01, F=108.5, P<0.01)。miR-19a-3p mimic组细胞增殖能力低于模型组(1.60±0.04比1.67±0.02, F=268.8, P<0.01),凋亡率和miR-19a-3p mRNA表达高于模型组[(6.36±0.08)%比(4.96±0.03)%,mRNA相对值:0.60±0.03比0.33±0.01, F=141.3、392.6, P<0.05],NF-κB p65的mRNA和蛋白表达低于模型组(mRNA相对值:1.59±0.02比3.80±0.07,灰度值比值:0.50±0.02比0.69±0.05, F=221.6、206.3, P<0.01),VEGF蛋白表达高于模型组(平均吸光度值:0.24±0.02比0.44±0.03, F=108.5, P<0.01)。 结论:miR-19a-3p调控NF-κB通路,抑制NF-κB p65蛋白磷酸化,从而介导乳腺癌细胞微环境抑制血管内皮细胞生长。
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编辑人员丨5天前
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野黄芩素通过miRNA-496和基质细胞衍生因子1对子宫颈癌细胞增殖及迁移的影响
编辑人员丨5天前
目的:探讨野黄芩素通过miRNA-496(miR-496)、基质细胞衍生因子1(SDF-1)对子宫颈癌细胞株HCC94细胞增殖及迁移能力的影响。方法:取对数生长期的HCC94细胞,分别加入20 μmol/L野黄芩素溶液(野黄芩素组)和二甲基亚砜(DMSO)(对照组)。分别采用CCK-8法和Transwell实验检测两组HCC94细胞增殖和迁移能力,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-496和SDF-1 mRNA的相对表达量。采用生物信息学软件TarBase预测miR-496的靶基因,并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。采用蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达情况。结果:与对照组比较,培养第3、4、5天,野黄芩素组HCC94细胞增殖能力均降低(均 P<0.05)。野黄芩素组和对照组HCC94细胞的穿胶细胞数分别为(25±5)个和(134±19)个,野黄芩素组细胞迁移能力较对照组降低( t=5.61, P<0.01)。对照组和野黄芩素组miR-496相对表达量分别为1.07±0.12和11.24±2.75,差异有统计学意义( t=3.68, P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验结果证实SDF-1是miR-496的下游靶基因。野黄芩素组和对照组HCC94细胞中SDF-1 mRNA相对表达量分别为0.29±0.05和1.01±0.07,差异有统计学意义( t=7.22, P<0.01)。与对照组比较,野黄芩素促进miR-496表达后,SDF-1蛋白、细胞增殖蛋白细胞周期蛋白依赖激酶3(CDK3)、细胞迁移蛋白Slug和Zeb-2表达均降低。 结论:野黄芩素可通过miR-496-SDF-1轴抑制子宫颈癌HCC94细胞的增殖及迁移。
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编辑人员丨5天前
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辐射诱导线粒体功能障碍激活转化生长因子β1通路促进胰腺癌细胞上皮间质转化
编辑人员丨5天前
目的:研究X射线照射后胰腺癌细胞上皮间质转化的发生特点,探究线粒体功能障碍及其诱导的转化生长因子β1(TGF-β1)表达增加在上皮间质转化中的作用。方法:采用6 MV X射线多次(2 Gy×20次或4 Gy×10次)照射胰腺癌细胞株PATU1 988 t,利用transwell小室检测细胞迁移性,采用实时荧光定量方法检测上皮间质转化(EMT)相关因子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和MMPs家族(MMP2、MMP9)及线粒体复合体I的关键亚基及TGF-β1的转录水平变化。应用线粒体氧化磷酸化解偶联剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)破坏线粒体膜电位,检测复合体亚基、TGF-β1含量及EMT相关分子的变化。应用小干扰RNA抑制TGF-β1的表达后,检测上皮间质转化及迁移变化。结果:多次照射后,存活肿瘤细胞迁移数增加( t=21.90、35.64, P<0.05),上皮间质转化增强,表现为上皮间质转化分子E-cadherin表达下降( t=8.37、6.77, P<0.05),N-cadherin( t=4.42、4.77, P<0.05)、Vimentin( t=4.57、3.02, P<0.05)、MMP2( t=7.27、26.08, P<0.05)和MMP9( t=13.26、7.29, P<0.05)表达均增加,TGF-β1( t=90.49、35.17, P<0.05)的含量也增加。沉默TGF-β1后细胞上皮间质转化及迁移性下降( t=38.66、11.54, P<0.05)。细胞发生线粒体功能障碍,具体表现为线粒体膜电位( t=6.94、29.71, P<0.05)和复合体相关亚基的表达量下降;加入CCCP破坏线粒体膜电位后( t=16.51, P<0.05),复合体亚基含量下降,TGF-β1的表达量增加( t=47.93, P<0.05),上皮间质转化增强。 结论:辐射破坏了线粒体功能,进而激活了TGF-β1的表达,诱导胰腺癌细胞发生上皮间质转化,迁移性增强。
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编辑人员丨5天前
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斯钙素2蛋白在胃癌腹腔转移中作用的实验研究
编辑人员丨5天前
目的:观察斯钙素2(STC2)蛋白在胃癌腹腔侵袭转移中的作用。方法:2018年6月至2019年4月利用腺病毒载体将短发夹RNA(shRNA)转染人胃癌SGC7901细胞(湖北省重点实验室提供)以沉默STC2,构建沉默STC2的SGC7901细胞株,分为实验组(STC2-shRNA组)及对照组(SGC7901组),并用蛋白质印迹法(Western blot)验证沉默STC2效果。构建裸鼠胃癌模型:选取6~8周龄雌性裸鼠36只(购自武汉大学动物实验中心),实验组及对照组各18只。经胃前壁大弯侧直接注射胃癌细胞SGC7901悬液接种构建鼠胃癌转移模型。接种后两组裸鼠成瘤数量、瘤体大小及重量比较采用 t检验;两组裸鼠腹腔各脏器成瘤率、抑瘤率、裸鼠生存时间、存活率、生命延长率等比较采用 χ2检验,最后Western blot检测两组胃癌肿瘤的血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、白细胞介素-10(IL-10)蛋白表达水平。 结果:Western blot实验显示,沉默STC2基因后,实验组细胞STC2蛋白量的表达较对照细胞明显减少,说明STC2沉默成功。接种8~15 d后裸鼠均有肿瘤生长,术区可触及质硬且活动不良结节。STC2-shRNA组裸鼠瘤体(0.76±0.14) mm 3、重量(1.23±0.14) g、数目(5.25±1.17)个,与SGC7901组[(3.61±0.44) mm 3、(3.98±0.21) g、(18.65±2.39)个]比较,差异有统计学意义( t=2.364、3.022、2.523, P<0.05)。STC2-shRNA组裸鼠胃、肝脏、脾、肾、肠及肠系膜、腹膜的成瘤率依次为50.0%、33.3%、11.1%、16.7%、22.2%、5.6%,SGC7901组成瘤率依次为100.0%、100.0%、55.6%、67.7%、72.2%、67.7%,STC2-shRNA组抑瘤率达到69.1%,两组各指标比较差异有统计学意义( χ2=5.464、5.995、7.281、5.462、9.826, P<0.05);STC2-shRNA组组裸鼠存活时间上明显延长,30 d后裸鼠存活14只,存活率77.8%,生命延长率达到64.5%,差异有统计学意义( χ2=6.044, P<0.05)。免疫组织化学结果显示,STC2-shRNA组VEGF-C、IL-10蛋白蛋白表达水平明显弱于胃癌细胞组,抑瘤率分别达到70.7%、71.4%。 结论:沉默STC2后的胃癌细胞SGC7901侵袭转移潜能下降,提示STC2可能有促进胃癌发生侵袭转移的作用。
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编辑人员丨5天前
