目的:基于网络药理学探讨决明子治疗高脂血症的作用机制,并通过斑马鱼实验进行验证.方法:在中药分子机制生物信息学注释数据库(BATMAN-TCM)和中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索并筛选决明子活性成分及相关靶点,通过GeneCards、DisGeNET、在线人类孟德尔遗传数据系统(OMIM)检索得到与高脂血症有关的靶点,利用Venny 2.1.0平台获得药物与疾病的共同靶点.使用Cytoscape3.8.2绘制决明子-活性成分-作用靶点网络图,采用String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图,将决明子-高脂血症共同靶点通过注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)进行基因本体(GO)功能及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.根据网络药理学研究结果,推测橙黄决明素(AO)为决明子降血脂的有效作用成分,在此基础上进行斑马鱼实验验证.以蛋黄液高脂饮食诱导斑马鱼高脂血症模型,造模后给予AO干预,验证AO治疗高脂血症的效果及作用机制.首先进行AO对高脂血症斑马鱼的毒性实验,确定AO最大给药浓度;后续观察AO对高脂血症斑马鱼总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)含量及肝脏组织形态学的影响;采用实时荧光定量PCR检测核心靶点mRNA在高脂血症斑马鱼中的表达.结果:共获得包括AO在内的13个决明子活性成分,决明子作用于高脂血症的潜在靶点109个,包括核心靶点肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)-1β、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)等,主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路、脂质和动脉粥样硬化相关作用通路等.斑马鱼验证实验结果显示:造模后斑马鱼出现明显的脂质聚积,AO可显著降低高脂血症斑马鱼组织中的TG、TC含量(P＜0.05,P＜0.01),减少肝脏组织内脂肪空泡和脂滴形成,并可显著下调核心靶点TNF-α、IL-1βmRNA表达(P＜0.01).结论:基于网络药理学获得了决明子治疗高脂血症的核心通路与靶点,并通过斑马鱼实验初步揭示AO对高脂血症的改善效果,其机制可能是通过TNF-α、IL-1β等核心靶点发挥治疗作用,旨在为后期研究AO在高脂血症中的临床应用提供参考依据.

目的 探讨siRNA沉默DJ-1基因体内外对人胃癌MGC803细胞的影响机制.方法 构建沉默DJ-1基因MGC803细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆、细胞划痕和侵袭实验检测沉默DJ-1基因对MGC803细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测DJ-1、PTEN、Akt、p-Akt、Snail、Vimentin、E-cadherin、基质金属蛋白酶9(MMP-9)与基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)的表达;相差显微镜观察DJ-1沉默对MGC803细胞形态学的影响;裸鼠实验检测DJ-1沉默对MGC803细胞移植瘤的影响.结果 分别用4组si-DJ-1及si-NC质粒转染MGC803细胞,其中si-DJ-1A组DJ-1 mRNA与蛋白表达下调较为显著(P＜0.001),则后续选用si-DJ-1A作为稳定沉默DJ-1基因MGC803细胞.MTT法检测结果显示,24、48和72 h后,si-DJ-1组增殖活性分别较MGC803对照组和si-NC组降低,均P＜0.001.克隆形成实验显示,si-DJ-1组克隆形成数较对照组与si-NC组减少,P＜0.001.划痕实验结果显示,si-DJ-1组迁移距离[(199.21±14.74)μm]较对照组[(302.62±17.70)μm]和si-NC组[(304.49+13.55)μm]缩短,P＜0.001.侵袭实验显示,si-DJ-1组侵袭细胞数[(44.80±5.10)个]较对照组[(83.80±5.80)个]和 si-NC 组[(82.80±5.80)个]减少,P＜0.001.与对照组和 si-NC 组相比,si-DJ-1 组 DJ-1 mRNA(F=18.350,P=0.003)、Snail mRNA(F=26.320,P＜0.001)、Vimentin mRNA(F=44.379,P＜0.001)与 MMP-9 mRNA(F=57.450,P＜0.001)下调,而 E-cadherin mRNA(F=94.529,P＜0.001)与 TIMP3 mRNA(F=16.480,P=0.004)上调;si-DJ-1 组 DJ-1(F=6.393,P=0.004)、p-Akt(F=12.980,P=0.007)、Snail(F=381.000,P＜0.001)、Vimentin(F=99.750,P＜0.001)与 MMP-9(F=126.800,P＜0.001)蛋白下调,而 PTEN(F=36.880,P＜0.001)、E-cadherin(F=181.000,P＜0.001)与TIMP3(F=217.800,P＜0.001)上调.相差显微镜显示,si-DJ-1组纤维母细胞样长梭形细胞肿瘤干细胞减少,圆形与椭圆形细胞增多,异型性下降.体内实验表明,si-DJ-1组移植瘤生长速度较对照组减慢,si-DJ-1 组移植瘤质量[(0.51±0.05)g]较对照组[(0.90±0.16)g]减小,t=5.273,P＜0.001.si-DJ-1 组较对照组 DJ-1、Ki-67、Vimentin和CD-34阳性表达降低,而PTEN和E-cadherin表达增强.结论 DJ-1沉默可通过PTEN/Akt通路体内外抑制MGC803细胞增殖、迁移、侵袭与上皮细胞-间充质转化.

目的 基于网络药理学方法和动物实验探讨桔梗白散治疗肺腺癌的作用靶点及机制.方法 借助TCMSP数据库及GeneCards、PharmGKB、DrugBank、TTD、OMIM数据库检索桔梗白散有效成分相关靶点及肺腺癌相关靶点,获取二者交集靶点,运用Cytoscape3.8.0软件构建交集靶点蛋白相互作用(PPI)网络和中药活性成分-靶点网络,筛选关键成分及核心靶点.对交集靶点进行GO和KEGG富集分析.运用PyMOL、AutoDockTools1.5.6软件对关键成分与核心靶点进行分子对接.建立肺癌小鼠模型,将小鼠随机分为空白组、模型组、顺铂组、桔梗白散联合顺铂组及桔梗白散低、中、高剂量组,给药组分别予相应药物干预14 d,计算抑瘤率,HE染色观察肿瘤组织形态,RT-qPCR及Western blot检测肿瘤组织PI3K、PTEN、Akt、mTOR基因及蛋白表达.结果 网络药理学方法筛选出桔梗白散治疗肺腺癌的TP53、CASP3、BCL2L1、AKT1等核心靶点,富集的关键通路有PI3K-Akt信号通路等.桔梗白散能有效抑制模型小鼠肿瘤生长;与模型组比较,桔梗白散中、高剂量组PI3K、Akt、mTOR mRNA表达降低,PTEN mRNA表达升高,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值降低,PTEN蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01).结论 桔梗白散治疗肺腺癌具有多层次、多靶点的特点,可能通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进肿瘤细胞凋亡与自噬,从而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用.

本文阐述了肌少-骨质疏松症所涉及的肌肉和骨骼间的复杂串扰和密切联系及其发病机制,并概括性指出其治疗难点在于需要同时兼顾肌肉和骨骼.还阐述了 Hedgehog通路对于胚胎发育、组织形态建立以及人体组织的再生和修复的关键作用.从肌肉干细胞的增殖和分化、前体细胞和肌纤维生成、抑制炎症和调控免疫3个方面探讨了 Hedgehog通路对骨骼肌的重塑作用;从促进骨形成和抑制骨吸收2个方面阐述了 Hedgehog通路在骨重建中的作用.

目的:探讨冬凌草甲素(Ori)调节Hippo/Yes相关蛋白(YAP)信号通路对骨质疏松(OP)大鼠成骨细胞凋亡的影响.方法:随机选取10只大鼠为假手术组仅分离但不切除卵巢,其余大鼠通过切除双侧卵巢建立OP模型,将造模成功的大鼠随机分为OP组、不同剂量Ori(5mg/kg Ori、10mg/kg Ori、20mg/kg Ori)组、20mg/kg Ori+Hippo/YAP 激活剂-Verteporfin(10mg/kg)组.干预后,收集腹主动脉血液,ELISA检测血清中骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)水平;分离股骨组织,双能X射线骨密度仪检测股骨矿含量、骨密度;HE检测股骨组织形态学变化;TUNEL检测成骨细胞凋亡变化;Western blot检测YAP、转录共激活因子PDZ结合基序(TAZ)蛋白表达.结果:假手术组大鼠股骨结构变化不明显,与假手术组相比,OP组股骨组织形态发生明 显改变,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨 密度、YAP、TAZ蛋白表达显著降低(P＜0.05),成骨细胞凋亡率显著增加(P＜0.05);与OP组相比,5mg/kg Ori组、10mg/kg Ori组、20mg/kg Ori组股骨组织形态得到改善,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨密度、YAP、TAZ蛋白表达显著增加(P＜0.05),成骨细胞凋亡率显著降低(P＜0.05),不同剂量Ori间具有统计差异(P＜0.05);与20mg/kg Ori组相比,20mg/kg Ori+V erteporfin组股骨组织形态变化加重,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨密度、YAP、TAZ蛋白表达显著降低(P＜0.05),成骨细胞凋亡率显著增加(P＜0.05).结论:Ori调节Hippo/YAP信号通路减少OP大鼠成骨细胞凋亡,减轻OP大鼠症状.

目的 基于网络药理学和动物实验探讨达原饮治疗幽门螺杆菌(Hp)阳性口周痤疮的作用机制.方法 通过TCMSP获取达原饮的有效活性成分及其对应靶点,从GeneCards、OMIM、TTD数据库检索Hp和口周痤疮靶点,取药物与疾病的交集靶点作为达原饮治疗Hp阳性口周痤疮靶点,采用Cytoscape3.7.2及STRING数据库构建交集靶点蛋白相互作用网络,筛选核心靶点,利用DAVID数据库与微生信平台对核心靶点进行GO和KEGG通路富集分析.采用Hp菌液灌服和痤疮丙酸杆菌混悬液皮内注射建立Hp阳性口周痤疮大鼠模型,观察达原饮干预效果,并对核心靶点及相关通路进行初步验证.HE染色观察口周皮肤及胃组织形态,ELISA检测大鼠口周皮肤组织Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子-κB(NF-κB)表达及血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量.结果 筛选出达原饮活性成分145个,对应靶点253个,药物与疾病交集靶点57个,达原饮治疗Hp阳性口周痤疮核心靶点为IL6、TNF、IL1B、AKT1、TP53等,KEGG通路富集分析得到153条信号通路,主要涉及癌症信号通路、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TLR信号通路、TNF信号通路等.达原饮能够下调Hp阳性口周痤疮大鼠口周皮肤组织TLR4、MyD88、NF-κB表达及血清TNF-α、IL-6含量(P<0.01).结论 达原饮可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路,降低炎症因子TNF-α、IL-6水平,减轻口周皮肤的炎症损伤,发挥对Hp阳性口周痤疮的治疗作用.

目的 构建含miR-155的人绒毛膜滋养层细胞来源外泌体,探讨miR-155通过外泌体携带对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖及成管能力的影响.方法 2023年1月至2023年4月于西安市人民医院(西安市第四医院)收集人体正常早孕流产绒毛组织进行人绒毛膜滋养层细胞原代培养,并提取、收集细胞上清中的外泌体;通过透射电镜、纳米粒子追踪分析(NTA)、Western-blot鉴定外泌体;通过药载技术构建含miR-155模拟物(Exo-miR-155 mimics)、抑制物(Exo-miR-155 inhibitor)以及对照物(Exo-NC)的外泌体;q-PCR检测外泌体中miR-155表达;将构建好的外泌体分别与HUVECs共孵育,荧光显微镜检测外泌体摄入情况;CCK-8、成管实验检测摄取外泌体后各组HUVECs细胞增殖、成管能力;q-PCR、Western-blot检测HUVECs中CYR61、VEGF表达水平.结果 分离培养的人绒毛膜滋养层细胞能够显著表达CK-7;人绒毛膜滋养层细胞培养液中提取的外泌体具有典型的形态、粒径并表达外泌体特征性蛋白CD9、CD63;载入外泌体中的miR-155表达与抑制效果显著;与摄取Exo-NC后的HUVECs相比,摄取Exo-miR-155 mimics后的HUVECs增殖与成管能力均下降;且细胞中CYR61 mRNA、VEGF mRNA及蛋白表达水平均降低.结论 miR-155可通过滋养层细胞来源外泌体的携带影响HUVECs增殖及成管能力,以及细胞中血管形成相关蛋白CYR61、VEGF的表达,进而与PE时胎盘功能建立异常和母体全身血管内皮细胞功能障碍相关.

目的 基于AMPK/ULK1信号通路观察归芪益元膏联合顺铂对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及作用机制.方法 小鼠右侧腋下接种Lewis肺癌细胞建立皮下肿瘤模型.将小鼠随机分为空白组、模型组、顺铂组和中药高、中、低剂量+顺铂组,每组10只,顺铂组腹腔注射顺铂5 mg/kg(每7 d一次),中药高、中、低剂量+顺铂组在顺铂组基础上分别予归芪益元膏7.0、3.5、1.75 g/kg灌胃,每日1次,连续14 d.HE染色观察小鼠肿瘤组织形态,免疫组化测定肿瘤组织p-AMPK、p-ULK1蛋白表达,透射电镜观测肿瘤组织自噬小体数量,RT-PCR测定小鼠肿瘤组织p62、Beclin-l、Atg5、LC3 mRNA表达,Western blot检测肿瘤组织Beclin-1、p62、Atg5、LC3和AMPK/ULK1信号通路蛋白表达.结果 与模型组比较,各给药组小鼠瘤质量明显降低(P<0.05);肿瘤组织出现片状坏死区域且自噬小体数量增加,Beclin-l、Atg5、LC3 mRNA表达升高,Beclin-1、Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1蛋白表达升高,p62 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05).与顺铂组比较,中药高、中剂量+顺铂组小鼠瘤质量降低(P<0.05),抑瘤率增加;中药高、中、低剂量+顺铂组小鼠肿瘤组织ULK1蛋白和Atg5 mRNA表达明显升高(P<0.05);中药高、中剂量+顺铂组Beclin-1、LC3 mRNA表达明显升高(P<0.05),Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、p-AMPK、p-ULK1蛋白表达明显升高(P<0.05),p62蛋白表达明显降低(P<0.05);中药高剂量+顺铂组p62 mRNA表达明显降低(P<0.05),Beclin-1蛋白表达明显升高(P<0.05).结论 归芪益元膏联合顺铂可能通过激活AMPK/ULK1信号通路促进肿瘤细胞自噬,进而抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠皮下肿瘤生长.

目的:探究圣草酚调节Yes相关蛋白(YAP)/转录共激活因子(TAZ)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的牙周膜干细胞(hPDLSC)成骨分化的影响.方法:采用结扎法进行大鼠牙周炎造模,造模成功后随机分为模型组和圣草酚组,每组6只,另取6只正常大鼠作为对照组.体外培养hPDLSC,以10μg/mL的LPS诱导的同时采用0、40、80、160、320、480μmoL/L的圣草酚处理,采用试剂盒检测各处理组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性后筛选圣草酚最佳作用浓度.将hPDLSC随机分为对照组、LPS组、LPS+圣草酚组、LPS+空载组、LPS+圣草酚+YAP敲低组,诱导其成骨分化并以LPS、圣草酚和质粒分组处理.采用HE染色观察牙周组织病理形态学变化;采用实时荧光定量PCR与免疫印迹实验检测各组牙周组织及细胞YAP、TAZ表达;采用ALP活性检测试剂盒、ALP染色及茜素红染色检测各组细胞成骨分化;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血清及细胞炎症因子前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素(IL)-6、IL-18水平;采用实时荧光定量PCR与免疫印迹实验检测各组牙周组织细胞成骨分化因子Runx2、OSX、骨桥蛋白(OPN)表达.结果:与对照组比较,模型组大鼠牙周组织呈现明显的病理损伤,血清PGE2、IL-6及与IL-18水平增高,牙周组织YAP、TAZ mRNA与蛋白表达降低(P＜0.05);与模型组相比,圣草酚组大鼠牙周组织病理损伤减轻,血清PGE2、IL-6及与IL-18水平下降,牙周组织YAP、TAZ mRNA与蛋白表达增高(P＜0.05).40、80、160、320、480μmoL/L的圣草酚均可升高LPS诱导的hP-DLSC中ALP活性(P＜0.05),其升高作用随着圣草酚浓度升高而增强并在320μmoL/L时达到平 台期,故选择320μmoL/L的圣草酚进行后续实验.与对照组相比,LPS组细胞 YAP、TAZ mRNA与蛋白表达、ALP阳性相对比例、ALP活性、矿化结节相对比例、Runx2及OSX、OPN mRNA与蛋白表达降低(P＜0.05),PGE2、IL-6及与IL-18水平升高(P＜0.05).与LPS组相比,LPS+圣草酚组细胞 YAP、TAZ mRNA与蛋白表达、ALP阳性相对比例、ALP活性、矿化结节相对比例、Runx2及OSX、OPN mRNA与蛋白表达升高(P＜0.05),PGE2、IL-6及与IL-18水平降低(P＜0.05);LPS+空载组细胞各指标无明显变化(P＞0.05).与LPS+圣草酚组相比,LPS+圣草酚+YAP敲低组细胞YAP、TAZ mRNA与蛋白表达、ALP阳性相对比例、ALP活性、矿化结节相对比例、Runx2及OSX、OPN mRNA与蛋白表达降低(P＜0.05),PGE2、IL-6及与IL-18水平升高(P＜0.05).结论:圣草酚可减轻牙周炎大鼠的炎症损伤,并通过上调YAP/TAZ通路蛋白表达抑制LPS诱导的hPDLSC炎症,从而促使其成骨分化.

目的 观察增液润燥汤对干燥综合征(SS)模型小鼠颌下腺组织相关mRNA和蛋白及外周血辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)表达的影响.方法 将SPF级BALB/c小鼠随机分为对照组和造模组,造模组通过免疫诱导法建立SS小鼠模型,对照组不予处理,将成模小鼠随机分为模型组、白芍总苷组和增液润燥汤低、中、高剂量组,每组3只.白芍总苷组予白芍总苷溶液0.234 mg/g灌胃,增液润燥汤低、中、高剂量组予增液润燥汤4、8、12 mg/g灌胃,对照组和模型组予等体积蒸馏水灌胃,每日1次,连续60 d.计算小鼠日饮水量、唾液流率、颌下腺指数,HE染色观察小鼠颌下腺组织形态,qPCR检测颌下腺组织同源异形盒基因A1(HOXA1)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)、白细胞介素-17(IL-17)、叉头框蛋白P3(FOXP3)mRNA和miR-181c-3p表达,Western blot检测颌下腺组织HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17、FOXP3蛋白表达,流式细胞仪检测外周血Th17、Treg比例.结果 与对照组比较,模型组小鼠日饮水量增加,唾液流率、颌下腺指数降低,颌下腺组织淋巴细胞浸润明显,HOXA1、STAT3、IL-17 mRNA表达升高,FOXP3 mRNA和miR-181c-3p表达降低,HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17蛋白表达升高,FOXP3蛋白表达降低,Th17比例、Th17/Treg升高,Treg比例降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,增液润燥汤各剂量组小鼠日饮水量减少,唾液流率升高,颌下腺组织淋巴细胞浸润均有不同程度减轻,HOXA1、IL-17 mRNA表达降低,FOXP3 mRNA和miR-181c-3p表达升高,HOXA1蛋白表达降低,FOXP3蛋白表达升高,Th17比例、Th17/Treg降低,Treg比例升高,增液润燥汤高剂量组颌下腺指数升高,STAT3 mRNA、蛋白表达及p-STAT3、IL-17蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 增液润燥汤可能通过上调miR-181c-3p、FOXP3表达,下调HOXA1、p-STAT3、STAT3、IL-17表达,调节Th17/Treg细胞平衡,改善SS所致颌下腺功能和组织损伤.