目的:探讨选择性腺苷A2受体激动剂5'-N-乙基酰胺基腺苷(5'-N-ethylcarboxamido adenosine,NEC A)对心肌线粒体自噬和呼吸功能的影响及可能机制.方法:培养大鼠心肌H9c2细胞,给予不同浓度NECA(10、100、1 000 nmol/L)处理2 h,对照组给予等体积PBS处理2 ho CCK-8法检测细胞活性;蛋白质印迹实验检测线粒体自噬及相关因子的表达水平;运用线粒体膜电位探针四甲基罗丹明乙酯(TMRE)检测线粒体膜电位;运用线粒体红色荧光探针Mitotracker Red和溶酶体绿色荧光探针Lysotracker Green同时标记细胞,并用激光共聚焦扫描显微镜记录线粒体和溶酶体的共定位情况;应用Oxygraph-2k高分辨率呼吸仪检测细胞线粒体呼吸功能.结果:与对照组相比,不同浓度NECA组细胞活力和线粒体膜电位均无显著变化.蛋白质印迹实验结果显示,与对照组相比,10 nmol/L和100 nmol/L NECA处理组线粒体的线粒体外膜转位酶20(TOM20)和内膜蛋白细胞色素C氧化酶Ⅳ亚型(COX Ⅳ)增高,1 000 nmol/L处理后,TOM20和COX Ⅳ较对照组无明显差异;而NECA对线粒体内膜转位酶23(TIM23)表达水平无显著影响.与对照组相比,加入10 nmol/L NECA处理后线粒体自噬相关因子FUN 14结构域包含蛋白1(FUNDC1)表达明显增加,100、1 000 nmol/L NECA处理对FUNDC1表达无显著影响;而NECA对同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)和帕金森蛋白(Parkin)表达水平无明显影响.共聚焦显微镜可见,与对照组相比,NECA处理组的溶酶体与线粒体共定位降低.Oxygraph-2k高分辨率呼吸仪检测结果显示,NECA处理组心肌H9c2细胞线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性与对照组相比无明显变化.结论:NECA抑制心肌H9c2细胞线粒体自噬但对线粒体呼吸功能无影响.

目的:采用性状鉴别和聚合酶链式反应(PCR)技术对我国主要的海马养殖品膨腹海马Hippocampus abdominalis Leeson进行研究,为该品种鉴别技术开发提供数据支持.方法:通过查阅文献资料并结合样品统计观察,总结膨腹海马的性状鉴别特征;根据膨腹海马及其他海马的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,筛选出膨腹海马的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,设计专属膨腹海马的引物PFHM-Primer-F和PFHM-Primer-R.通过优化PCR体系反应条件,考察最佳的PCR反应体系.结果:膨腹海马的核心性状特征主要包括有较多的体环、尾环和背鳍条数,背鳍覆盖 4 个体环+1 个尾环;眼周和鳃盖部具有明显的大而黑的斑点等.基于COⅠ序列展开的PCR鉴别方法研究表明,当退火温度为 65℃,循环 30 次时,膨腹海马样品在 100～250 bp呈现单一明亮条带,而其他品种均无此条带.结论:建立的性状鉴别和特异性PCR鉴别方法可快速鉴别膨腹海马,为我国海马新资源的鉴别和后续开发提供参考.

目的:开发一种针对水牛角的特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法,快速、准确地鉴别水牛角与其他混伪品.方法:通过比对水牛、黄牛、牦牛、山羊等动物的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CO Ⅰ)基因序列差异,筛选水牛的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,设计出相应的鉴别引物,并对影响PCR体系的相关条件进行优化,考察验证方法的耐受性和适用性.结果:PCR条件为扩增体系 20 μL、退火温度 60℃、循环次数 32 次、DNA模板量为 100 ng、10 μmol·L-1 正反引物对各 0.8 μL时,使用设计的鉴别引物SN1 对水牛角进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳后出现约 358 bp的特异性条带,其他物种的样品均无条带出现.结论:该PCR鉴别方法特异性好,能迅速、准确地鉴别水牛角和其他常见动物角类样品,为水牛角的真伪鉴别提供参考.

目的 评估亚洲璃眼蜱在普氏野马分布区域传播疾病的潜在风险,研究雌、雄蜱在宏基因组水平的特征并进行病原体分析.方法 2022年4月,在新疆卡拉麦里山有蹄类自然保护区使用"守株待蜱"法采集硬蜱,利用体视镜进行形态学鉴定,提取48只蜱(雌、雄各24只)DNA,PCR扩增线粒体细胞色素C氧化酶第1亚基(COⅠ)序列进行分子生物学鉴定.将雌、雄亚洲璃眼蜱分组进行宏基因组测序,非冗余基因集与非冗余蛋白(NR)数据库进行比对,分析蜱携带的微生物群落组成;与京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库和抗生素抗性基因数据库(ARDB)进行比对,获取蜱及蜱传病原体的基因功能注释结果以及抗生素抗性功能注释结果.数据的比较采用t检验分析.结果 共采集硬蜱124只,经形态学鉴定亚洲璃眼蜱成虫119只.硬蜱DNA扩增出约700 bp的阳性条带,经测序与亚洲璃眼蜱(GenBank:MH459386.1)的序列一致性为99％～100％.宏基因组测序经质控过滤共获得469 327 812条序列读长,开放阅读框预测得到836 843～1 094 994条序列.NR数据库比对结果显示,亚洲璃眼蜱携带的细菌菌落丰度占注释到的总群落丰度的99.13％,共注释到细菌32门2 040种,变形菌门和放线菌门为优势菌门,分别占细菌群落丰度的51.52％和44.35％;嗜吞噬细胞无形体为优势菌种,占细菌群落丰度的16.35％.病毒菌落丰度占注释到的总群落丰度的0.004％,共注释到病毒5 门 21种.雌蜱和雄蜱携带的细菌群落和病毒群落的丰富度及多样性差异均无统计学意义(t=-1.180、-1.729,均P＞0.05).KEGG基因功能注释到亚洲璃眼蜱新陈代谢基因占比最高(54.38％),主要的功能条目为氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜转运等;共识别出11 352种蛋白通路,其中154种蛋白通路在雌蜱和雄蜱间的差异有统计学意义(t=-2.348,P＜0.05).ARDB注释到亚洲璃眼蜱携带154种抗生素抗性基因,包括49种抗性基因类型,主要抗性基因类型为Baca(占62.53％),抗生素类型为肝菌肽.大部分注释到的抗性基因与多重耐药相关,如Mexf、Mexb、Emrd、Mexw等.雌蜱和雄蜱在抗生素抗性基因类型的差异性对比结果显示,仅雌蜱的Emrd基因抗性高于雄蜱(t=-7.558,P＜0.05).结论 本研究在宏基因组水平上揭示了亚洲璃眼蜱携带的主要细菌、病毒群落及多重耐药相关的抗生素抗性基因,雌蜱及其携带的病原体具有较高的物种丰度和基因丰度.

目的:总结mtDNA8344A>G突变临床表型谱，探讨其临床新表型。方法:回顾性分析首都儿科研究所附属儿童医院2019年4月收治的以急性中枢性呼吸衰竭起病mtDNA8344A>G突变患者一家系，对该家系先证者及其母亲进行临床资料收集、总结，并文献复习。结果:该先证者为4岁男童，以快速进展的中枢性呼吸衰竭起病，持续机械辅助通气，血清乳酸水平波动于4.5~8.3 mmol/L，头颅磁共振成像可见延髓背侧至第1及第2颈椎水平脊髓线性异常信号，肌肉活组织检查（活检）病理可见不整红边纤维、破碎蓝纤维、细胞色素C氧化酶阴性肌纤维以及血管琥珀酸脱氢酶反应增强，符合线粒体肌病样病理特征；肌肉组织呼吸链酶复合物活性检测结果为线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ和复合物Ⅳ活性联合降低；外周血淋巴细胞及尿液脱落上皮细胞均检测到mtDNA8344A>G突变，血中的突变比例为91.08%，尿中突变比例92.64%。患儿母亲30岁，体形消瘦，无明显的临床症状及体征，其外周血及尿液中亦均检测到mtDNA8344A>G突变，血淋巴细胞中突变比例为77.29%，尿脱落上皮细胞中突变比例为90.13%。结论:本文报道了1例以快速进展中枢性呼吸衰竭起病的患儿及其家系，基因检测发现mtDNA8344A>G突变，同时肌肉活检病理和肌肉组织呼吸链酶复合物活性检测结果均支持线粒体病诊断，通过该病例扩充了该基因的表型谱。

目的:探索神经生长因子（NGF）在小鼠治疗性血管生成中诱导缺血肢体骨骼肌纤维重塑的机制。方法:雌性ICR小鼠18只，无特定病原体级，6周龄，体重25~30 g。按随机数字表法分为假手术组（ n=6）、空白对照组（ n=6）和NGF基因治疗组（ n=6）。对空白对照组和NGF基因治疗组小鼠进行后肢缺血造模，在术后第7天对假手术组注射生理盐水，空白对照组小鼠进行空质粒转染，NGF基因治疗组小鼠进行NGF基因转染。在术后第21天对患肢血流灌注评估后进行腓肠肌取材。对3组腓肠肌标本进行苏木精-伊红（HE）染色，CD31和增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组织化学染色，实时荧光定量PCR检测肌球蛋白重链（MHC）-Ⅰ、MHC-Ⅱa及MHC-Ⅱb的mRNA表达，Western blot检测NGF和过氧化物酶体增殖物激活受体-β/δ（PPAR β/δ）的表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞色素C氧化酶（COX）、异柠檬酸脱氢酶（IDH）和三磷酸腺苷（ATP）表达量。 结果:术后第21天，NGF基因转染组小鼠患肢血流灌注量为（195.70±9.99）PU，低于假手术组（312.15±17.32）PU（ P=0.001），但高于空白对照组（82.11±8.55）PU（ P=0.001）。NGF组的肌肉萎缩程度低于空白对照组，NGF基因转染组的毛细血管密度为（0.34±0.05），高于假手术组（0.11±0.03）和空白对照组（0.27±0.04）（均 P<0.05）。NGF基因转染组的内皮细胞增殖指数为（0.39±0.19），高于假手术组（0.18±0.01）和空白对照组（0.25±0.14）（均 P<0.05）。NGF基因转染组的NGF、PPAR β/δ、COX、IDH、ATP的表达水平，以及MHC-ⅠmRNA表达水平较假手术组和空白对照组均明显升高（均 P<0.05）。 结论:NGF基因转染后能够促进小鼠缺血肢体毛细血管生成，增加其血流灌注，进而诱导骨骼肌肌纤维向Ⅰ型重塑，该过程可能与NGF诱导PPAR β/δ表达，促进骨骼肌细胞有氧代谢有关。

目的:观察狼疮鼠肝脏组织细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（MT-CO1）、BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）和IL-1β表达特点及其意义。方法:以实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测狼疮鼠和对照鼠MT-CO1和BNIP3、IL-1β、线粒体微管相关蛋白1轻链3β（LC3B）、p16和p21的mRNA和蛋白水平，苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学法检测狼疮鼠肝组织，免疫组织化学明确IL-1β在狼疮鼠肝组织的炎症损害表达部位，比色法检测2组肝组织丙二醛表达差异；以脂多糖刺激肝细胞和巨噬细胞，同时以脂多糖刺激巨噬细胞后上清液培养肝细胞，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测上述基因蛋白表达，比色法检测各组肝细胞丙二醛表达差异。免疫荧光检测线粒体活性氧（mtROS）表达。各组均数比较使用单因素方差分析法，多个样本均数之间的两两比较，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Tamhane′s T2法。 结果:PCR结果显示，狼疮鼠肝组织MT-CO1和BNIP3的mRNA（0.14±0.04；0.16±0.05）较对照组（0.11±0.04；0.16±0.06）表达明显下降，差异具有统计学意义（ t=7.16， P<0.001； t=4.54， P<0.001），狼疮组IL-1β、p16和p21（2.06±0.69；0.37±0.14；0.16±0.06）较对照组（0.23±0.07；0.25±0.08；0.11±0.04）表达显著增高，差异具有统计学意义（ t=9.58， P<0.001； t=24.35， P<0.001； t=22.36， P<0.001）。蛋白质印迹法结果与PCR结果趋势一致。HE染色显示狼疮鼠肝组织中有淋巴细胞浸润，免疫组织化学显示狼疮鼠肝组织中IL-1β阳性细胞主要集中在血窦中，肝实质细胞表达不明显。狼疮组肝组织丙二醛的含量（0.19±0.10）高于对照组（0.17±0.09），差异具有统计学意义（ t=4.33， P=0.005）。与对照组（0.176±0.072；0.08±0.03）相比，脂多糖直接刺激AML12肝细胞MT-CO1、BNIP3 mRNA表达（0.069±0.028；0.17±0.07）无明显变化，差异无统计学意义（ t=1.01， P=0.337； t=0.88， P=0.399）；脂多糖刺激巨噬细胞IL-1β（0.28±0.09）较对照组（0.15±0.05）表达增高，差异具有统计学意义（ t=28.26， P<0.001）。以脂多糖刺激巨噬细胞12 h后的上清培养肝细胞24 h，MT-CO1和BNIP3在脂多糖刺激组的mRNA水平（0.046±0.026；0.17±0.05）较对照组（0.144±0.083；0.18±0.06）表达明显下降，差异具有统计学意义（ t=7.52， P<0.001； t=4.24， P<0.001），脂多糖刺激组p16和p21（0.29±0.09；0.27±0.09）较对照组（0.18±0.06；0.22±0.07）表达增高，差异具有统计学意义（ t=13.54， P<0.001； t=8.69， P<0.001）。蛋白质印迹法结果与PCR结果趋势一致。免疫荧光提示脂多糖刺激组（0.25±0.10）mtROS荧光强度高于对照组（0.08±0.03），差异具有统计学意义（ t=4.86， P<0.001）。 结论:狼疮鼠肝脏免疫炎症可以刺激肝脏实质细胞发生细胞内线粒体功能损害，狼疮鼠肝脏器官损害机制不止局限于免疫活性细胞的免疫炎症，还有实质细胞线粒体功能障碍共同参与。

目的 探讨吗啡(Mor)对缺氧/复氧(H/R)诱发的心肌H9c2细胞线粒体动力学变化的影响.方法 将心肌H9c2细胞分为空白组(正常培养)、模型组(H/R 处理)、对照组(5 μmol·L-1 Mor 处理)、实验组(H/R+5 μmol·L-1 Mor处理).用透射电子显微镜(TEM)观察线粒体的形态,用活性氧(ROS)、四甲基罗丹明乙酯(TMRE)、线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ活性检测试剂盒分别检测ROS含量、线粒体膜电位(MMP)、复合体Ⅰ和Ⅲ活性,用蛋白质印迹法检测线粒体动力学相关蛋白GTP酶动力蛋白相关蛋白1(Drp1)、细胞色素氧化酶Ⅳ亚型(COX Ⅳ)和线粒体外膜转位酶20(TOM20)蛋白的表达水平.结果 实验组细胞核膜光滑完整,线粒体大小一致,嵴排列整齐,空泡化减少,线粒体基质电子密度增加,自噬体数量减少.空白组、模型组、对照组和实验组细胞的ROS含量分别为1.03±0.04、1.53±0.10、1.06±0.06 和 1.10±0.11,MMP 分别为 1.00±0.15、0.80±0.16、1.06±0.19 和 1.00±0.19,复合体 Ⅰ 活性分别为 1.00±0.08、2.28±0.82、1.05±0.26 和 1.13±0.37,复合体 Ⅲ 活性分别为 1.00±0.09、2.13±0.38、0.83±0.22和0.96±0.11,Drp1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.14、1.27±0.07、0.97±0.21 和0.93±0.17,线粒体裂变蛋白 1(Fis1)蛋白相对表达水平分别为 1.00±0.16、1.33±0.18、1.17±0.25 和 0.99±0.05,COX Ⅳ蛋白相对表达水平分别为1.00±0.25、0.62±0.08、0.79±0.26和0.97±0.16,TOM20 蛋白相对表达水平分别为 1.00±0.13、0.67±0.15、0.75±0.13和0.89±0.05.模型组的上述指标与空白组比较,在统计学上差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.000 1);实验组的上述指标与模型组比较,在统计学上差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.000 1).结论 吗啡可能通过抑制心肌线粒体自噬和分裂,以及降低呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ的活性减轻氧化应激损伤,进而维持线粒体动力学稳态,减轻H/R诱发的心肌细胞损伤.

目的 建立一种龟甲配方颗粒高分辨熔解曲线(HRM)技术鉴别方法.方法 根据乌龟Chinemys reevesii及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ,COI)基因序列上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点设计鉴别引物,扩增产物直接进行HRM分析,并优化反应体系,根据最佳条件进行适用性验证.结果 在模板DNA质量浓度为0.62～374.88 ng/μL、引物浓度为0.1～0.4 μmol/L、退火温度为62℃、循环数为45个的条件下,龟甲饮片和配方颗粒的熔解曲线为单峰,其Tm均值分别为(82.39±0.09)、(82.38±0.05)℃,而混伪品和醋龟甲配方颗粒未有扩增.结论 该研究建立的高分辨熔解曲线鉴别方法可快速鉴别龟甲原料和配方颗粒的真伪,以及区分其生品和炮制品配方颗粒,为龟甲配方颗粒的质量标准研究提供了理论依据.

目的 通过研究化浊解毒补肾方含药血清对过氧化氢(H2O2)诱导大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)氧化应激的影响,进一步探讨该方治疗绝经后女性肝纤维化的机制.方法 制备化浊解毒补肾方含药血清和正常血清.将肝星状细胞随机分为空白组、模型组、空白血清组、氟维司群(ICI 182780,以下简记为ICI)组、中药组、中药+ICI组、雌二醇(estradiol,E2)组、E2+ICI组,随后按照分组处理细胞.采用流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxy-gen species,ROS)水平;ELISA 法检测 细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平;免疫荧光染色法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达;Western Blot法检测胞浆细胞色素 C(cytochrome C)、环氧化酶-Ⅰ(cyclooxygenase-Ⅰ,COX-Ⅰ)、α-SMA、Ⅰ 型胶原蛋白(collagen Ⅰ)表达.结果 与空白组比较,模型组细胞中ROS、MDA水平和α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达以及α-SMA平均荧光强度均明显升高(P＜0.0001,P＜0.001),SOD水平、cytochrome C、COX-Ⅰ蛋白表达均明显降低(P＜0.0001);与模型组比较,中药组和E2组ROS、MDA水平和α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达以及α-SMA平均荧光强度均有明显降低(P＜0.0001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05),SOD 水平、cytochrome C、COX-Ⅰ 蛋白表达均有明显升高(P＜0.0001);与中药组和E2组比较,在各自加入ICI处理后,对应的ROS、MDA水平和α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达以及α-SMA平均荧光强度均有明显升高(P＜0.0001,P＜0.001,P＜0.05),SOD水平和cytochrome C、COX-Ⅰ蛋白表达均有明显降低(P＜0.001,P＜0.05,P＜0.01).结论 化浊解毒补肾方含药血清可通过雌激素受体降低ROS、MDA水平和α-SMA、collagenⅠ蛋白表达以及α-SMA平均荧光强度,提高SOD水平和cytochrome C、COX-Ⅰ蛋白表达,从而提高抗氧化能力,减轻氧化应激反应,最终起到防治绝经后女性肝纤维化的作用.