目的:在乙型肝炎病毒（HBV）阳性人血清体外感染人肝癌细胞株（HepaRG）的实验模型中进行依折麦布对HBV的抑制作用研究。方法:将成熟HepaRG细胞分成加药物的处理组和不加药物的对照组。在依折麦布预防实验中，处理组均是在感染前2 h及感染24 h期间对细胞进行药物处理；在依折麦布治疗实验中，处理组均是在细胞被HBV感染24 h后，立即用药物对其进行连续6~10 d的处理。用荧光定量PCR方法检测上清液中HBV DNA及细胞内cccDNA的表达量，用化学发光法检测细胞上清液中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）的含量。多组间差异比较用方差分析，组间两两对比中服从正态分布的采用 t检验，以 P < 0.05为差异有统计学意义。 结果:依折麦布预防实验显示感染前及感染时加20、60、100 μmol/L依折麦布的处理组与对照组相比，处理组前2 d上清液HBV DNA含量明显下降（ P < 0.05）；60 μmol/L依折麦布处理组与对照组相比，前2 d上清液中HBsAg表达水平明显下降（ P < 0.05）；100 μmol/L依折麦布处理组与对照组相比，10 d后细胞内cccDNA表达水平明显降低（ P < 0.05）。依折麦布治疗实验显示细胞被感染24 h后，立即添加60 μmol/L依折麦布处理10 d，细胞中cccDNA含量明显低于对照组（ P < 0.05）。 结论:无论是在预防实验还是治疗实验中，入胞抑制剂依折麦布对HBV的感染均存在一定的抑制作用。

目的:建立乙型肝炎病毒（HBV）阳性血清体外感染人肝癌细胞（HepaRG）的实验模型，并探索入胞抑制剂Myrcludex-B在体外感染模型中对HBV的抑制作用。方法:将诱导成熟的HepaRG细胞分成加聚乙二醇（PEG）的感染组和无PEG的感染组，再将两种感染组分别分为添加Myrcludex-B肽段的处理组和不添加Myrcludex-B肽段的对照组，用HBV DNA阳性患者的血清对细胞进行感染。取细胞上清液，用荧光定量PCR检测上清液中HBV DNA的表达量，用化学荧光法检测细胞上清液中HBsAg、HBeAg的含量。两组间计量资料不服从正态分布的采用秩和检验，服从正态分布的采用 t检验，以 P < 0.05为差异有统计学意义。 结果:在处理组中，加PEG感染组和不加PEG感染组的病毒滴度分别为（103 877.00±49 013.24）拷贝/ml、（5 050.09±631.26）拷贝/ml；在对照组中，加PEG感染组和不加PEG感染组的病毒滴度分别为（116 188.57±50 957.19）拷贝/ml、（5 119.34±1 102.43）拷贝/ml，两组中加PEG感染组的病毒滴度显著高于不加PEG感染组（ P < 0.05），差异有统计学意义。在加PEG的感染组中，加肽段处理组和无肽段对照组的病毒滴度分别为（103 877.34±49 013.24）拷贝/ml、（116 188.57±50 957.19）拷贝/ml，加肽段处理组病毒滴度明显下降（ P < 0.05），差异有统计学意义；该组0、1、2、3 d上清液中HBsAg的含量均为阳性，且0 d上清液中加肽段处理组的HBsAg较无肽段对照组呈明显下降趋势。 结论:用添加PEG的HBV DNA阳性血清体外感染HepaRG细胞的实验模型是可行的，且在该试验模型中，入胞抑制剂Myrcludex-B对HBV感染存在一定的抑制作用。

目的 通过网络药理学和体外细胞实验,探究垂盆草保护急性肝损伤的有效成分及潜在的功能机制.方法 利用网络药理学和生物信息学预测垂盆草的有效成分、主要活性成分和靶点.800 μl的四氯化碳(CCl4)处理肝细胞Hep-aRG 2 h,构建肝细胞损伤模型;10 μmol/L异鼠李素或白细胞介素(IL)-17 信号通路激活剂SR0987 处理HepaRG细胞,再CCl4溶液培养 2 h.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肝损伤生化指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH);细胞计数试剂盒(CCK8)、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡;逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、Western印迹检测IL-17 mRNA和蛋白表达.结果 中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、中医药综合数据库(TC-MID)分析垂盆草得到 5 种主要活性成分,302 个靶基因;疾病相关的基因与突变位点数据库(DisGeNET)、人类孟德尔遗传数据库(OMIM)分析肝损伤得到 398 个靶基因,与有效成分靶基因取交集,共有 177 个靶基因.通过对靶基因的京都基因组百科全书(KEGG)富集分析和基因本体论(GO)富集分析发现,IL-17 信号通路富集率和差异均最高.体外细胞实验表明,成功构建CCl4 诱导HepaRG细胞模型,模型细胞ALT、AST、LDH、MDH含量均显著升高,增殖率显著降低,凋亡率显著升高,IL-17 mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05);异鼠李素处理后,这些指标的变化均得到抑制.SR0987 处理后明显减弱异鼠李素的作用.结论 垂盆草的主要活性成分异鼠李素通过抑制IL-17 信号通路的活性发挥肝保护作用.

目的 使用一种在微米尺度空间对流体进行操控,以模拟体内微环境为主要特征的微流控肝器官芯片技术,评价雷公藤提取物(Tripterygium wilfordii extract,TWE)和雷公藤多苷片提取物(Tripterygium Glycosides Tablet extract,TGE)的肝脏毒性,比较微流控-精密肝切片、静态-精密肝切片、微流控-HepaRG细胞培养体系的差异性.方法 将新鲜的大鼠肝脏进行精密切片处理后,分别置于静态/微流控培养体系中进行培养,微流控-HepaRG细胞培养体系则是将HepaRG细胞接种到己预先接种人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的培养小室中加药培养;TWE终质量浓度为0.30、0.60、1.20mg/mL(以生药量计),TGE终质量浓度为31.25、62.50、125.00μg/mL,共孵育24h后进行肝脏损伤标志物的测定及形态学观察.结果 在不额外添加药物的正常培养情况下,微流控/静态精密肝切片培养上清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、总胆汁酸(total biliary acid,TBA)的表达均明显高于微流控-HepaRG细胞培养体系.与TWE和TGE共培养后,微流控-精密肝切片培养体系中,高剂量的TWE和TGE均可导致培养上清中ALT、LDH和谷氨酰转移酶(gamma glutamyl transferase,GGT)活性的显著升高,TWE还可以显著升高总胆红素(total bilirubin,TBil)的含量,并显示出一定的量-毒关系;而在静态-精密肝切片培养体系中,仅中剂量的TGE可导致ALT和LDH活性的显著升高,且未见剂量相关性;在微流控-HepaRG细胞培养体系中,仅GGT的含量显 著升高.组织病理学检查结果显示,TWE和TGE低、中、高剂量对共培养体系中的HUVECs形态均未见明显影响,说明受试药不影响共培养体系的血管仿生结构;TWE和TGE在微流控培养体系或静态培养体系下,低、中、高剂量均会对精密肝切片造成不同程度的损伤,肝细胞出现不同程度肿胀,弥漫性肝细胞核溶解、消失,肝细胞索结构松散,但仅在微流控-精密肝切片培养体系下,形态学的改变呈现出一定的剂量相关性;在微流控-HepaRG细胞培养体系中,仅高剂量的TWE和TGE可导致细胞形态的明显改变.结论 在微流控-精密肝切片培养体系下,TWE和TGE所造成的肝损伤特点一致,具有明显的量-毒关系,表明微流控肝器官芯片技术可以更灵敏、更准确地反映出受试物对肝脏的损伤情况,且有可能成为临床前中药肝毒性评价的新的技术手段.

建立及评价体外肝脏3D模型在药物肝毒性评价中的优势.本研究利用悬滴技术构建HepaRG3D多细胞聚球体模型,并检测其肝功能水平,最后用该模型评价2个肝毒性阳性药重复给药毒性,并与2D模型下单次给药毒性进行比较.HepaRG细胞聚集生长形成微组织体,该模型的细胞白蛋白表达水平、尿素分泌水平和CYP3A4活性诱导水平均显著高于2D模型.盐酸胺碘酮在2D和3D培养模型下IC50分别为50和100 μmol·L-1;异烟肼在2D模型下IC50＞1 mmol·L-1,3D模型下IC50为700 μmol·L-1.两个药物在3D模型下LDH活性均呈现明显的时间/给药次数依赖性和剂量正相关性.结果提示成功建立体外肝脏3D悬滴培养模型,与2D模型比较,该模型可用于准确评价肝毒性阳性药,并为将来体外准确、高通量和多次长期给药评价药物肝脏毒性提供可能.

目的 利用正常人源肝细胞(HepaRG)和高内涵技术检测肝毒性标志物,并结合微核试验和单细胞凝胶电泳试验建立体外细胞毒性和遗传毒性的快速筛选平台.方法 选取适当的荧光探针Hoechst33342、DCFH-DA、Fluo4-AM、MitoTracker(R) Red CMX Ros联合高内涵技术研究不同大黄蒽醌类单体(AQs)对HepaRG细胞活性氧簇(ROS)、胞内Ca2+含量及线粒体膜完整性等肝毒性标志物的影响,并开展高内涵法胞质分裂阻断法微核试验和高通量彗星电泳试验,综合评价AQs致肝细胞毒性及染色体、DNA损伤情况.结果 与对照组比较,HepaRG细胞经25.0 μg/mL大黄素、12.5和25.0μg/mL芦荟大黄素、50和25.0 μg/mL大黄酚处理24h后,胞内ROS含量显著增多;12.5和25.0 μg/mL芦荟大黄素和50.0μg/mL大黄酸可引起胞内Ca2+含量显著增多;大黄素25.0 μg/mL、芦荟大黄素25.0 μg/mL、大黄酚50.0和25.0 μg/mL、大黄酸50.0和25.0 μg/mL组导致线粒体明显损伤(P＜0.05、0.01).与对照组比较,25.0 μg/mL大黄素诱导微核率、尾DNA含量和彗星尾距(OTM)数值均显著升高(P＜0.05、0.01);50.0 μg/mL大黄酚给药72 h后微核率显著升高(P＜0.01).结论 AQs的研究结果与现有文献报道基本相符.本研究成功建立肝细胞毒性和遗传毒性的联合快速筛选模型,有助于药物研发早期的毒性筛选.

目的 利用HepaRG细胞,探讨补骨脂二氢黄酮甲醚毒性剂量及其毒性作用机制.方法 MTT法确定毒性及剂量.以浓度为6.25、12.5、25 μmol·L-1的补骨脂二氢黄酮甲醚作用于细胞24 h后,首先利用Hoechst 33342/PI及LDH的方法检测细胞死亡,并检测凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、caspase-3活性.通过检测线粒体膜电位、ATP含量、线粒体膜通道开放孔开放性及细胞色素C的含量,观察其对线粒体损伤的影响.结果 补骨脂二氢黄酮甲醚给药24 h后,凋亡蛋白Bax/Bcl-2比例、caspase-3活性随药物浓度增大而增加,在6.25~25 μmol·L-1时,其凋亡率呈现明显的剂量依赖性,但在25 μmol·L-1时细胞以坏死为主.作用24 h后线粒体损伤相关指标明显加剧.结论 补骨脂二氢黄酮甲醚作用于HepaRG细胞后通过损伤线粒体诱导细胞凋亡和坏死.

目的 以柴胡的主要药效/毒性成分柴胡皂苷(SS)及代谢产物(共30种化合物)为研究对象,预测并验证部分靶点蛋白.方法 ①通过PharmMapper反向分子对接法和Sybyl X正向分子对接预测SS及其代谢产物的潜在靶点蛋白,并预测了柴胡皂苷a(SSa)与潜在靶点蛋白谷胱甘肽S转移酶A2(GST A2)间的结合模式.②体外实验:用SSa 0,0.03,0.06,0.13,0.25和0.50 mmol·L-1处理HepaRG细胞24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率;HepaRG细胞用SSa 0,0.03,0.13和0.50 mmol·L-1处理24 h,GST活性检测试剂盒检测细胞GST酶活性.结果 ①PharmMapper和Sybyl X预测SS及代谢产物的潜在靶点蛋白包括:GST A2、磷脂酰胆碱转移蛋白、腺苷激酶、胸苷酸合成酶、雌激素受体、雌二醇17-β-脱氢酶1、原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pim1、胆汁酸受体和维A酸结合蛋白2.预测结果显示,SSa与GST A2之间对接得分最高,二者匹配良好,很可能存在相互作用.②体外实验:SSa能抑制HepaRG细胞存活,呈一定的量效关系(R 2=0.8848,P<0.05);随着SSa浓度升高,细胞内GST活性升高(P<0.01).结论 SS及其代谢产物的潜在靶点蛋白为GST和磷脂酰胆碱转移蛋白等,GST可能是SSa的靶点蛋白之一.

目的 探讨孕烷X受体(PXR)在对乙酰氨基酚(APAP)诱导的药物性肝损伤中的作用.方法 HepaRG细胞经不同浓度APAP(1.85、3.70、7.40、14.8、29.6和59.2 mmol/L)处理,观察其形态改变,检测上清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平,PXR的表达;瞬时转染PXR-siRNA到HepaRG细胞,敲减PXR后通过观察上清ALT、AST水平变化,明确APAP对HepaRG细胞毒性的变化.ICR小鼠随机分成正常对照组、APAP 150和300 mg/kg剂量组,检测APAP对血清ALT、AST水平、肝组织病理学和PXR表达的影响.采用PXR激动剂干预,观察其对APAP肝毒性的影响.结果 APAP可引起HepaRG细胞明显的毒性反应,诱导PXR mRNA的表达;PXR敲减可减轻APAP对HepaRG细胞的肝毒性.体内实验结果显示,APAP 300 mg/kg可明显引起小鼠肝损伤,并显著诱导PXR的表达,PXR激动剂可进一步加重APAP诱导的肝损伤.结论 PXR激活在APAP引起的DILI中起着重要的促进作用.毒性剂量下的APAP在体内外均可诱导PXR的表达,进而引起明显的肝损伤.

目的 研究苦参碱对HepaRG细胞增殖、周期及凋亡的影响并初探其机制.方法采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl-)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测不同浓度(0.5,1,2,4 mg/mL)苦参碱对HepaRG细胞活力的影响;检测苦参碱给药后,HepaRG细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力;采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色观察HepaRG细胞形态学变化;利用流式细胞仪检测苦参碱对HepaRG细胞内活性氧和线粒体膜电位变化;利用Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡变化;利用PI/RNase检测细胞周期变化.结果MTT和LDH结果显示苦参碱能明显抑制HepaRG细胞活力,并呈时间与剂量依赖关系;DAPI染色发现随着药物浓度升高,细胞形态发生明显变化,出现核固缩,呈亮蓝色,形成凋亡小体等.流式结果表明苦参碱能使HepaRG细胞内活性氧升高,线粒体膜电位水平下降;与对照组相比,给药组HepaRG细胞出现明显的凋亡细胞,且细胞凋亡率随苦参碱浓度增大而逐渐升高;给药组HepaRG细胞处于G0/G1期的细胞数减少,S期的细胞增多,表明苦参碱能将HepaRG细胞的细胞周期阻滞在S期.结论苦参碱在体外对HepaRG细胞有明显的细胞毒性作用,其机制可能是通过增加活性氧,使线粒体功能受损,改变细胞周期分布,诱导细胞凋亡.