目的:探讨磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路、活性氧簇(ROS)、醛酮还原酶家族1成员C3(AKR1C3)在瘢痕疙瘩形成中的可能作用及机制。方法:从昆明医科大学第一附属医院皮肤科收集9例瘢痕疙瘩组织标本(男6例，女3例，年龄24~40岁)，以及6例进行其他手术的志愿者正常皮肤组织标本(男4例，女2例，年龄20~45岁)，部分行组织包埋，部分行成纤维细胞原代培养。(1)免疫组织化学检测瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中AKT(丝氨酸磷酸化位点473)[p-AKT(S473)]、AKT(苏氨酸磷酸化位点308)[p-AKT(T308)]和AKR1C3的蛋白相对表达量。(2)CCK-8法检测不同浓度(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)PI3K特异性抑制剂2-吗啉代-8-苯基色酮(LY294002)对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制作用，并筛选出LY294002最佳的实验浓度。(3)以ROS检测试剂盒分别检测不同浓度(0、4、6、8、10、12 mmol/L)ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和15 mmol/L LY294002对瘢痕疙瘩成纤维细胞内ROS水平的影响。(4)将瘢痕疙瘩或正常皮肤成纤维细胞分为对照组(正常培养不进行任何处理)、二甲基亚砜(DMSO)组(0.002% DMSO处理)、LY294002组(15 mmol/L LY294002处理)和NAC组(6 mmol/L NAC处理)，定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法分别检测成纤维细胞中AKT mRNA、AKR1C3 mRNA及p-AKT(S473)、p-AKT(T308)和AKR1C3蛋白的表达水平。采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据以 ± s表示，两组间比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两多重比较采用SNK- q检验， P<0.05表示差异有统计学意义。 结果:(1)免疫组织化学检测结果显示，瘢痕疙瘩组织中p-AKT(S473)、p-AKT(T308)和AKR1C3的蛋白表达水平分别为16.75±3.30、16.20±1.56、26.69±2.50，均显著高于正常皮肤组织的4.02±1.50、1.82±0.50、1.47±1.07( P<0.01)。(2)瘢痕疙瘩成纤维细胞经不同浓度LY294002干预24 h后，15~50 mmol/L LY294002组成纤维细胞增殖抑制率显著高于对照组(0 mmol/L组)( P<0.01)。LY294002最佳实验浓度为15 mmol/L。(3)不同浓度NAC作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞1 h后，各组间ROS水平差异有统计学意义( P<0.01)，且6 mmol/L NAC组ROS水平(0.72±0.03)最低。15 mmol/L LY294002组ROS水平显著低于对照组(0 mmol/L组)(0.80±0.01 vs. 0.86±0.01， P<0.01)。(4)qPCR检测结果表明，瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组中AKT、AKR1C3 mRNA表达量分别为1.38±0.09、1.40±0.05，明显高于正常皮肤成纤维细胞的0.97±0.10、0.98±0.03( P<0.01)；经15 mmol/L LY294002处理后，瘢痕疙瘩成纤维细胞AKT mRNA表达量明显低于正常皮肤(0.73±0.05 vs. 0.89±0.06， P<0.01)；经6 mmol/L NAC处理后，瘢痕疙瘩成纤维细胞AKR1C3 mRNA低于正常皮肤(0.43±0.05 vs. 0.86±0.03， P<0.01)。蛋白质印迹法检测结果显示，瘢痕疙瘩成纤维细胞中p-AKT(S473)、p-AKT(T308)、AKR1C3蛋白表达量分别为1.19±0.21、0.92±0.04、0.73±0.08，明显高于正常皮肤的0.24±0.06、0.33±0.05、0.31±0.05( P<0.01)；经15 mmol/L LY294002和6 mmol/L NAC处理后，瘢痕疙瘩成纤维细胞中p-AKT(S473)蛋白表达量分别为0.92±0.04、0.80±0.20, p-AKT(T308)蛋白表达量分别为0.42±0.04、0.81±0.05，均明显高于正常皮肤(0.23±0.03、0.22±0.05，0.30±0.06、0.32±0.05)，但瘢痕疙瘩成纤维细胞AKR1C3蛋白表达量(0.23±0.05)在15 mmol/L LY294002处理后低于正常皮肤(0.30±0.07)，在6 mmol/L NAC处理后(0.33±0.07)高于正常皮肤(0.28±0.06)( P>0.05)。 结论:活化的PI3K/AKT信号通路和AKR1C3促进了瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及瘢痕疙瘩形成。同时，瘢痕疙瘩成纤维细胞内AKR1C3的升高可加速ROS升高。

目的:探讨SMARCA4(SWI/SNF-related,matrix-associated,actin-dependent regulator of chromatin,subfamily A,member 4)在铁死亡中的作用和分子机制.方法:(1)培养人纤维肉瘤细胞系HT1080,设置对照[二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)]组和不同浓度(31.25、62.5和125 nmol/L)Ras选择性致死小分子3(Ras-selec-tive lethal small molecule 3,RSL3;铁死亡诱导剂)处理组,每组3个复孔;利用Western blot检测细胞中SMARCA4蛋白水平.(2)利用2条小干扰RNA敲减HT1080细胞的SMARCA4基因,并将细胞分为阴性对照组和SMARCA4基因敲减(siSMARCA4-1和siSMARCA4-2)组,每组3个复孔;利用Western blot检测3组细胞中SMARCA4蛋白水平;利用高内涵细胞成像分析系统检测DMSO、坏死抑素2外消旋体(necrostatin 2 racemate,Nec-1s;坏死性凋亡抑制剂)、N-苯甲基氧化碳酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮[Z-VAD(OMe)-FMK,Z-VAD;广谱caspase抑制剂/凋亡阻断剂]和铁抑素1(ferrostatin-1,Fer-1;铁死亡抑制剂)处理后3组细胞的存活率;利用RT-qPCR和流式细胞术检测3组细胞的铁死亡指标:前列腺素内过氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)基因转录、脂质过氧化、总活性氧(reactive oxygen species,ROS)、不稳定铁池(labile iron pool,LIP)和谷胱甘肽;利用RT-qPCR检测3组细胞中铁代谢基因、调控铁死亡的ROS调节基因和胆固醇合成关键基因的转录水平;利用高内涵细胞成像分析系统检测胆固醇处理后3组细胞的存活率.(3)对已发表的在线数据进行共同差异基因分析和基因本体论(gene on-tology,GO)富集分析.结果:(1)RSL3处理降低SMARCA4蛋白水平(P＜0.05).(2)敲减SMARCA4导致细胞铁死亡.(3)敲减SMARCA4不通过影响LIP或调控铁死亡的ROS调节基因的转录水平而导致铁死亡.(4)敲减SMARCA4影响细胞膜、脂筏相关通路和胆固醇合成;(5)补充胆固醇可以挽救敲减SMARCA4导致的铁死亡(P＜0.01).结论:铁死亡诱导剂RSL3处理降低人纤维肉瘤HT1080细胞中的SMARCA4蛋白水平,且敲减SMARCA4通过抑制胆固醇合成导致HT1080细胞铁死亡.

目的 探索血清IgG唾液酸化修饰在肝棘球蚴病诊断及鉴别中的应用价值.方法 采集西藏自治区、甘肃省、四川省、青海省2014-2016年的98例肝细粒棘球蚴病患者和29例肝多房棘球蚴病患者血样,广西医科大学附属医院2017年1-12月的30例肝癌住院患者血样,广西医科大学体检科22份健康体检者血样.提取各组血样的血清,每份50μl,采用基于荧光色谱的糖组学技术对血清中IgG的唾液酸化修饰进行定量分析.使用Protein G琼脂糖纯化试剂盒分离纯化血清中的IgG.取50 μg纯化后的IgG样品,在25 mmol/L二硫苏糖醇溶液和50 mmol/L碘乙酰胺溶液中进行还原烷基化反应后加入1μl N-糖苷酶缓冲液,酶解后采用石墨化碳小柱进行糖链的富集并将其冷冻干燥后溶于二甲基亚砜和冰醋酸的7∶3(v/v)混合溶液中,快速加入5 mmol/L的2-氨基苯酰胺溶液和10 mmol/L氰基硼氢化钠溶液各50μl,反应2h后,使用石墨碳小柱纯化.将标记后的糖链在Waters Acquity UPLC(H-Class)系统上进行亲水色谱柱分离,荧光检测器设置的激发和发射波长分别为330 nm和420nm,分析样品的单唾液酸化修饰、双唾液酸化修饰以及总唾液酸化修饰.采用Empower 3软件进行数据收集和处理,SPSS 25进行数据统计分析,数据的比较采用D'Agostino&Pearson omnibus正态分布检验(P1值)与单因素方差分析检验(P2值),两两之间的比较采用Tukey's multiple comparisons test分析(P3值).结果 IgG糖链的色谱图共检测到21个IgG糖链峰,其中单唾液酸化修饰糖链5种,分别为FA2BG1S1(17.79min)、A2G2S1(19.02 min)、A2BG2S1(20.02min)、FA2G2S1(20.27 min)和FA2BG2S1(21.13 min);双唾液酸化修饰糖链4种,分别为A2G2S2(22.70min)、A2BG2S2(23.29min)、FA2G2S2(23.78min)和FA2BG2S2(24.26min).各组血清样品各类唾液酸化修饰的含量均具有正态分布特性(P1＞0.1).肝细粒棘球蚴病组、肝多房棘球蚴病组血清IgG单唾液酸化修饰含量分别为(14.15±2.89)％和(10.24±2.97)％,双唾液酸化修饰含量分别为(3.02±0.98)％和(1.92± 0.65)％,总唾液酸化修饰含量分别为(17.25±3.69)％和(12.27±3.65)％,均低于健康对照组的(16.55±2.95)％、(3.71±1.04)％和(20.26±3.79)％(F=23.70、11.14、22.98,均P2＜0.0001).其中肝细粒棘球蚴病组与肝多房棘球蚴病组相比,单唾液酸化修饰、双唾液酸化修饰和总唾液酸化修饰含量差异有统计学意义(t=6.352、4.701、6.392,P3＜0.0001).利用受试者工作曲线(ROC)进行了 IgG唾液酸化修饰潜在诊断性能的评估,肝细粒棘球蚴病组与肝多房棘球蚴病组间AUC为0.829(95％CI:0.738～0.921),灵敏度和特异性分别为82.7％和87.7％.肝癌组的血清IgG的单唾液酸化修饰、双唾液酸化修饰和总唾液酸化修饰含量分别为(15.09±2.68)％、(3.28± 1.30)％和(18.37±3.69)％,与肝多房棘球蚴病组的差异有统计学意义(t=6.587、4.318、6.372,P3＜0.000 1),肝多房棘球蚴病组和肝癌组间IgG总唾液酸化修饰ROC的AUC为0.881(95％CI:0.793～0.963),灵敏度和特异性分别为86.7％和93.1％.结论 本研究发现了血清IgG唾液酸化修饰可能与肝棘球蚴病的发病机制有关,在肝棘球蚴病诊断,肝细粒棘球蚴病与肝多房棘球蚴病、肝癌与肝多房棘球蚴病的鉴别研究中具有一定的应用价值.

目的:建立1H核磁共振波谱绝对定量法和相对定量法测定氘代新药甲苯磺酸多纳非尼中非氘代杂质的含量.方法:采用氘代二甲基亚砜-重水(10∶1)混合溶剂,以90°脉冲,弛豫延迟时间15 s,扫描次数64次,测试温度25 ℃为采样条件.加入马来酸作为内标物,以马来酸化学位移δ6.29的内标峰和非氘代杂质δ2.79的特征定量峰计算非氘代杂质的绝对含量;不加入任何内标物,以δ8.63的芳香1H峰和82.79的非氘代杂质特征1H峰为定量峰,计算非氘代杂质对甲苯磺酸多纳非尼的相对含量.并将2种定量方法测定结果与液质联用法进行比较.结果:2种测定方法的定量限、线性、精密度、准确度及稳定性经验证均符合要求.对3批商业化样品进行测定,2种定量方法测定结果分别为0.14％、0.14％、0.14％和0.14％、0.13％、0.14％,与液质联用法测定结果基本一致.结论:建立的1 H核磁共振波谱绝对定量法和相对定量法准确、灵敏,可用于测定甲苯磺酸多纳非尼中非氘代杂质的含量,且具有操作简单、分析时间短、无需杂质对照品的优势,也为其他氘代药物中非氘代杂质的测定提供了借鉴.

目的 研究绿藻孔石莼Ulva pertusa的化学成分.方法 采用硅胶、ODS、Diaion HP-20、Sephadex LH-20等柱色谱和制备HPLC等技术进行分离纯化,根据理化性质和谱学数据鉴定化合物结构.结果 从孔石莼乙醇提取物中分离得到18个化合物,分别鉴定为异植物醇(1)、3-吲哚甲酸(2)、1-O-十六碳酰基-3-O-(6'-硫代-α-D-脱氧毗喃葡萄糖基)甘油(3)、(2S)-1-O-十六碳酰基-3-O-[α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基]甘油(4)、3-甲基亚砜基丙酸(5)、3-氯丙酸(6)、酪醇(7)、对羟基苯甲酸(8)、对羟基苯乙酸(9)、6-乙烯基己内酯(10)、黑麦草内酯(11)、向日葵香波龙大柱酮D (12)、壬二酸(13)、琥珀酸(14)、8-羟基-(6E)-辛烯酸(15)、3-乙氧基丙酸(16)、正丁基-β-D-吡喃果糖苷(17)、焦谷氨酸正丁酯(18).结论 化合物1～16为首次从孔石莼中分离得到,化合物5、6、10、15和16为首次从天然产物中分离得到,化合物17和18为提取过程中产生的β-D-吡喃果糖苷和焦谷氨酸人工产物.

[目的]预测假单胞菌甲硫氨酸亚砜还原酶A(缩写:pmMsrA)的结构中与催化活性相关的结合位点与活性基团.[方法]采用生物信息分析软件对筛选出的pmMsrA的基因和蛋白序列进行分析,用SWISS-MODEL软件构建pmMsrA蛋白的三维结构,使用AutoDock软件实现pmMsrA与底物分子的模拟对接.[结果]pmMsrA的基因开放阅读框669bp,编码222个氨基酸,理论等电点为4.87,分子量为24.6 kDa.pmMsrA属于高度保守的甲硫氨酸亚砜还原酶(PMSR)超家族.多重序列比对得出pmMsrA和模板1 FVA具有58％的相似性,可构建一个高质量的pmMsrA蛋白三维结构模型.pmMsrA蛋白的催化活性位点位于“GCFWG”模体结构的Cys-60,C-末端的Cys-206和Cys-214对pmMsrA的再生循环起重要的作用.分子对接结果显示底物与酶的可能结合位点是136位天冬酰胺(136N),137位天冬氨酸(137D)和204位酪氨酸(204Y).[结论]获得pmMsrA的生物信息相关预测参数,成功构建pmMsrA的三维结构,并实现与底物S-苯甲亚砜的空间模拟对接.

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA,商品名伏立诺他)是否能通过提高限制型心肌病小鼠野生型心肌肌钙蛋白I(WT-cTnI)的表达以改善其舒张功能.方法 选取雄性3月龄cTnI R193H限制型心肌病模型小鼠16只并随机分为SAHA组(n=6)、二甲基亚砜(DMSO)组(n=5)和对照组(n=5),分别给予SAHA 50mg/kg、DMSO 1ml/kg、生理盐水1ml/kg皮下注射,持续56d.采用Western blotting检测小鼠心肌细胞核组蛋白H3的乙酰化水平(acH3)及cTnI蛋白表达水平,采用染色质免疫共沉淀法(ChIP)比较cTnI编码基因Tnni3启动子GATA和MEF2关键区域acH3水平,采用荧光定量PCR检测Tnni3的mRNA表达水平,应用小动物高频超声仪评估小鼠心功能.结果 与对照组比较,SAHA组心肌细胞核acH3水平和Tnni3启动子关键区域acH3水平均明显升高(P＜0.05);与DMSD组比较,SAHA组心肌细胞核acH3水平无明显改变(P＞0.05),Tnni3启动子关键区域的acH3水平明显升高(P＜0.05).3组cTnI蛋白和Tnni3mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,DMSO组心脏收缩指标左室缩短分数(LVFS)、左室射血分数(LVEF)、每搏输出量(SV)、心输出量(CO)及舒张指标等容舒张时间(IVRT)、E峰减速时间(DT)、舒张早期充盈血流(E峰)、舒张晚期充盈血流(A峰)无明显改变(p＞0.05),Tei指数及E/A比值明显升高(P＜0.05);SAHA组IVRT、DT明显延长(p＜0.05),Tei指数明显增高(P＜0.05),E峰、A峰明显降低(P＜0.05),E/A比值明显改变,LVFS、LVEF、SV、CO明显降低(p＜0.05).与DMSO组比较,SAHA组IVRT明显升高(P＜0.05),E峰、E/A比值明显下降(P＜0.05),LVFS、LVEF、CO明显降低(P＜0.05).结论 50mg/kg SAHA干预可上调限制型心肌病小鼠心肌细胞Tnni3启动子GATA&MEF2区域acH3水平,但对cTnI蛋白和Tnni3 mRNA表达以及心脏舒张功能可能没有改善作用,甚至会损害其舒张功能和收缩功能.

建立测定常山碱绝对含量的核磁共振氢谱定量分析方法.采用Bruker Ascend 600 MHz超导核磁共振仪,在298 K下,以氘代二甲基亚砜为溶剂,对苯二酚为内标,在频率600 MHz,谱宽7 211Hz,脉冲宽度(P1)9.70μs,zg30脉冲序列,扫描次数(NS) 32次,弛豫时间(D1)2 s的条件下采集常山碱样品的氢谱.以化学位移在δ7.71的常山碱双峰和化学位移在δ6.55的对苯二酚的单峰作为定量峰,将样品与内标选定峰的峰面积比对其质量比回归得到标准曲线方程为Y=0.083 3X+0.008 6,r为0.999 6.常山碱的线性范围为2.17 ～ 17.07 g·L-1,精密度试验RSD为0.78％(n=6),重复性试验RSD为1.2％(n=6),测得3批常山碱样品量分别为94.91％,95.09％和95.52％.采用高效液相色谱法测得常山碱的含量为96.44％,二者的相对误差为1.27％.结果表明,核磁共振氢谱内标法可用于常山碱绝对含量的测定.

目的 改进抗真菌药艾沙康唑的合成工艺.方法 R-乳酸甲酯与吗啉发生氨解反应后用3,4-二氢吡喃保护得到(R)-1-(4-吗啉基)-2-羟基-1-丙酮,再与2,5-二氟苯基溴化镁经格氏反应得到(R)-1-(2,5-二氟苯基)-2-[(2-四氢吡喃基)氧基]-1-丙酮,然后与三甲基碘化亚砜、三氮唑反应后脱THP保护基,并成甲磺酸盐得到高纯度的(2R,3R)-2-(2,5-二氟苯基)-1-(1,2,4-三唑基)-2,3-丁二醇甲磺酸盐;然后进一步分子内关环后与三甲基氰硅烷反应得到(2S,3R)-3-(2,5-二氟苯基)-3-羟基-2-甲基-4-(1,2,4-三唑基)丁腈,最后经水解、硫代,再与4-溴乙酰基苄腈环合即得艾沙康唑.结果与结论 工艺优化后目标化合物的总收率为12.5％(以R-乳酸甲酯计),纯度为100％(HPLC面积归一化法),ee值也达到100％,改进后的工艺反应条件温和、后处理简便,有利于工业化生产.

为从土壤环境中分离筛选产嗜热酯酶的菌株, 利用三丁酸甘油酯筛选培养基, 从沼气堆肥发酵周边的土壤中筛选到1株产酯酶的菌株YJ 1-1, 根据其形态特征、生理生化特征及16S r DNA序列分析, 初步确定为嗜麦寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia) .菌株YJ 1-1生产的酯酶在以对硝基苯酚丁酸酯为底物时, 酶活性最高 (2.87 U/mg), 其最适反应温度为75℃, 最适反应p H为7.0, 且该酶表现出极强的温度稳定性和有机溶剂耐受性, 75℃处理12 h, 其酶活性没有明显的变化, 70％ (体积分数) 的甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亚砜、乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂对酯酶活性均有激活作用, 分别使酯酶活性提高了2.30、4.65、2.05、1.30、5.02、1.74、1.09和2.12倍.上述特征使得该酯酶可应用于工业生产过程中.