目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:观察长链非编码RNA(lncRNA)特异性核基质结合区结合蛋白1(SATB1)-AS1在前列腺癌中的表达，并分析lncRNA SATB1-AS1与SATB1的相关性。方法:采用荧光原位杂交(FISH)方法检测前列腺癌及其癌旁组织中SATB1-AS1表达。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测4株前列腺癌细胞株(PC3、DU145、22RV1、LNCAP)和人正常前列腺上皮细胞株(RWPE1)中SATB1-AS1表达。应用TCGA数据库及整合基因组浏览器(IGV)软件比对SATB1与SATB1-AS1的相关性。结果:荧光杂交结果显示，SATB1-AS1在定位在细胞核、细胞质。RT-qPCR结果显示在前列腺癌细胞22RV1、LNCAP中SATB1-AS1表达水平明显高于DU145、PC3(4.20±1.25、42.58±8.30和0.50±0.02、1.58±0.33， F＝22.512， P<0.05)。TCGA数据库分析SATB1-AS1与SATB1呈正相关( r＝0.670， P<0.001)；IGV软件比对美国国立生物技术信息中心(NCBI)内发现SATB1启动子序列与SATB1-AS1部分序列完全重合。 结论:SATB1-AS1在前列腺中表达，且可能通过与SATB1基因启动子结合进而调控SATB1基因表达。

目的:了解河北省保定地区2020年全部新诊断的HIV-1感染者中，HIV-1毒株基因型和耐药发生情况。方法:使用自建的方法扩增HIV-1 pol区全长基因并测序，系统进化分析鉴定HIV-1亚型，将基因序列上传至美国斯坦福大学的HIV耐药数据库，分析耐药突变位点发生情况。 结果:共收集新诊断HIV-1感染者96例，获得 pol区全长83条，研究人群中男性88例(91.7%)，平均年龄为39岁，已婚者54例(56.3%)，感染途径以性接触途径(95.8%，92/96)为主，其中同性性传播占75.0%(72/96)；系统进化分析显示，HIV-1毒株亚型多样，以CRF01_AE(51.8%，43/83)、CRF07_BC(24.1%，20/83)和B亚型(10.8%，9/83)为主，近年来新鉴定的重组毒株占13.3%(11/83)；耐药分析结果显示，治疗前耐药率为8.4%(7/83)，其中蛋白酶抑制剂(PIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)和整合酶抑制剂(INIs)的耐药率分别为3.6%(3/83)、1.2%(1/83)和3.6%(3/83)。 结论:河北省保定地区2020年新诊断HIV-1感染者中毒株亚型复杂多样，存在多种独特重组毒株和耐药突变毒株，需要加强耐药监测和防控。

目的:确定临床分离菌株产气克雷伯菌整合子、质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)基因的分布，并分析整合子与临床常用抗菌药物耐药性的关系。方法:收集2015年11月至2021年3月上海市奉贤区中心医院分离自临床样本中的产气克雷伯菌91株，PCR筛查第1、2类整合酶基因( intI1、 intI2)，分析启动子类型和可变区基因盒组成结构。同时对分离株PMQR基因进行检测，并分析整合子与临床常用抗感染治疗药物间的关系。 结果:91株产气克雷伯菌对氨曲南耐药率>40.00%，对其余常用抗菌药物耐药率均<35.00%。91株产气克雷伯菌中30株检出 intI1，未检出 intI2。第1类整合子检出7种可变区基因盒组合，在产气克雷伯菌中检出基因盒组合 aac(6′)-11 C- ΔereA2- IS1247- aac3- arr- ΔereA2。第1类整合子可变区启动子以活性较弱的PcH1启动子为主。 intI1阳性菌株与 intI1阴性菌株在ICU、神经外科和临床其他科室的检出率差异有统计学意义( P<0.05)。 intI1阳性菌株对部分临床常用抗菌药物耐药率明显高于 intI1阴性菌株( P<0.05)。 qnrS为PMQR基因的主要基因型。除2016年外，其余年份分离的产气克雷伯菌中整合子和PMQR基因的检出率均较低。 结论:产气克雷伯菌耐药性的产生与整合子密切相关，产气克雷伯菌中整合子在不同临床科室的分布具有一定的差异性，ICU和神经外科应持续加强细菌耐药的监测。 qnrS是本地区产气克雷伯菌对喹诺酮类药物产生耐药的主要原因。

目的:探讨解整合素金属蛋白酶12（ADAM12）基因在大骨节病患者软骨细胞损伤中的作用及其对胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）相关基因的影响。方法:由就诊于西安交通大学附属红会医院的5例大骨节病患者和5例对照受试者获得关节软骨样本，体外提取并培养关节软骨细胞。分别采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法检测大骨节病患者与对照受试者软骨细胞ADAM12 mRNA和蛋白表达水平。然后，采用慢病毒进行大骨节病患者软骨细胞ADAM12基因过表达实验，MTT法检测ADAM12基因过表达后细胞活性变化，并采用qRT-PCR检测软骨细胞分化相关基因Y染色体性别决定区-盒转录因子9（SOX9）、Ⅱ型胶原（COLⅡ），凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（BAX）以及合成代谢相关基因IGFBP3、IGFBP5 mRNA表达水平。结果:大骨节病患者软骨细胞ADAM12 mRNA和蛋白表达水平（0.57 ± 0.05、0.81 ± 0.07）均显著低于对照受试者（1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00），差异均有统计学意义（ t = - 24.50、- 3.61，均 P < 0.05）。MTT法结果显示，ADAM12过表达组软骨细胞活性（1.09 ± 0.05）高于空载体对照组（1.00 ± 0.08），差异有统计学意义（ t = 4.12， P = 0.031）。qRT-PCR结果显示，与空载体对照组比较，ADAM12过表达组IGFBP3（2.35 ± 0.79比0.96 ± 0.25）、IGFBP5（2.13 ± 0.30比0.98 ± 0.34）、SOX9（2.92 ± 0.51比0.94 ± 0.36）和COLⅡmRNA表达水平（6.45 ± 2.81比0.87 ± 0.19）均较高，差异均有统计学意义（ t = 3.19、5.16、6.27、4.10，均 P < 0.05）；而BAX mRNA表达水平（0.31 ± 0.06比1.02 ± 0.22）较低，差异有统计学意义（ t = - 11.16， P < 0.001）。 结论:ADAM12基因在大骨节病患者软骨细胞损伤中可能有抑制凋亡和促进分化的作用，其过表达能够使IGFBP3和IGFBP5表达升高。

目的:观察整合素连接激酶-小干扰RNA-特异性腺相关病毒(ILK-siRNA-AAV)对大鼠青光眼滤过术后滤过通道瘢痕形成的抑制作用。方法:选取SPF级8~9周龄SD大鼠48只，采用随机数表法将其分为空白对照组、ILK-siRNA-AAV组、NC-siRNA-AAV组和丝裂霉素C(MMC)组，每组12只。每只大鼠均取左眼为实验眼，右眼不做特殊处理。采用前房植入引流管法建立大鼠青光眼滤过术球结膜滤过泡模型，空白对照组、ILK-siRNA-AAV组和NC-siRNA-AAV组术后1 d滤过泡内分别注入磷酸盐缓冲液、ILK-siRNA-AAV和NC-siRNA-AAV各5 μl，MMC组术中采用含0.4 mg/ml MMC的小棉片置于结膜瓣下5 min。术前及术后1、2、3、7、14、21、28 d，采用手持式眼压计测量术眼眼压；术后1、2、3、7、14、21、28 d，采用手术显微镜观察术眼滤过泡形成情况，采用Kaplan-Meier生存分析计算滤过泡生存天数；术后28 d，采用逆转录PCR及Western blot法检测术区结膜及结膜下组织中ILK的mRNA及蛋白表达，检测ILK基因沉默效应；采用苏木精-伊红染色观察 ILK基因沉默对滤过通道组织形态的影响；采用Masson染色观察 ILK基因沉默对球结膜滤过泡术区组织胶原纤维沉积作用，计算胶原纤维染色阳性面积占整个组织视野面积的百分比。 结果:各组大鼠手术前后不同时间点眼压总体比较，差异均有统计学意义( F分组＝76.84， P<0.001； F时间＝114.49， P<0.001)，其中ILK-siRNA-AAV组术后第1、7、14和28天眼压均低于空白对照组，MMC组术后第2、3、7、14和28天眼压均低于空白对照组，ILK-siRNA-AAV组术后第7、14、21和28天眼压均低于NC-siRNA-AAV组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示，空白对照组、NC-siRNA-AAV组、ILK-siRNA-AAV组和MMC组滤过泡生存天数分别为(3.50±1.51)、(5.00±3.41)、(31.50±3.15)和(31.33±2.46)d，总体比较差异有统计学意义( F＝395.83， P<0.05)，其中ILK-siRNA-AAV组和MMC组滤过泡生存天数均多于空白对照组和NC-siRNA-AAV组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。各组ILK mRNA及蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义( F＝222.32、752.69，均 P<0.05)，其中ILK-siRNA-AAV组ILK mRNA及蛋白相对表达量明显低于空白对照组和NC-siRNA-AAV组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。苏木精-伊红染色结果显示，空白对照组和NC-siRNA-AAV组术区纤维结缔组织增生，细胞大量增生，成纤维细胞密度高，呈团块状生长；ILK-siRNA-AAV组球结膜较薄，纤维结缔组织排列疏松，少量成纤维细胞增生；MMC组结膜纤维层疏松、菲薄，形成空洞，细胞稀少。各组胶原纤维染色阳性面积百分比总体比较差异有统计学意义( F＝741.66， P<0.05)，其中与空白对照组比较，ILK-siRNA-AAV组和MMC组阳性染色百分比显著降低，ILK-siRNA-AAV组阳性染色百分比明显低于NC-siRNA-AAV组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:ILK-siRNA-AAV沉默ILK表达可抑制大鼠滤过术后滤过区组织瘢痕形成，降低眼压。

目的:设计基于纳米荧光素酶(Nluc)的新型荧光报告系统，构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN，分析该噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性的能力。方法:构建P furAma启动子控制表达的Nluc荧光报告系统，将其整合至耻垢分枝杆菌基因组中，测试其在分枝杆菌的荧光报告能力；随后将P furAma- nluc报告系统整合到TM4分枝杆菌噬菌体基因组中，构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN；通过调整药物预处理时间、感染时间等条件，建立ΦFN检测分枝杆菌耐药性的快速检测流程，在96孔板中检测52株已知耐药性的结核分枝杆菌临床分离株对3种一线抗结核药物耐药的耐药性。 结果:整合型表达荧光报告系统P furAma- nluc的耻垢分枝杆菌可报告下限达到100菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)，低于已报道的P left启动子表达 nluc系统。新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN可通过孔板读值法在24 h内检测到分枝杆菌的存在，检测下限达到100 CFU。药物与待测菌预培养48 h后再加入噬菌体孵育24 h，敏感菌在10 5 CFU以下均无法检测到荧光信号，可有效区分敏感株并进行耐药性的快速检测。以罗氏药敏实验作为金标准，使用ΦFN检测52株结核分枝杆菌临床菌株对利福平、异烟肼和链霉素的耐药性，检测准确性分别是51/52、48/52、49/52。 结论:利用新型重组荧光报告噬菌体检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素的耐药性具有极高的准确性，报告时间仅需3 d，有望成为一种快速简便的结核分枝杆菌耐药性检测新方法。

目的:了解我国HIV-1 CRF55_01B感染者抗病毒治疗前对蛋白酶类抑制剂(PI)、核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、整合酶抑制剂(INSTIs)的耐药程度以及耐药株的传播关系。方法:对2018年全国抗病毒治疗前HIV耐药监测中CRF55_01B重组亚型感染者的血浆样本提取RNA，分别扩增蛋白酶/逆转录酶(PR/RT)区基因片段1 056 bp和整合酶(IN)区基因片段846 bp并测序，利用美国斯坦福大学HIV db Program数据库中全部收录药物进行耐药判定，运用HIV-TRACE软件进行HIV-1耐药传播网络分析，并重点分析了CRF55_01B整合酶基因区遗传多态性位点的突变情况。结果:共分析来自全国26个省的178份样本，获得CRF55_01B PR/RT区序列170条以及对应样本的IN区序列170条，总体耐药率为15.3%(26/170)。PIs、NRTIs、NNRTIs、INSTIs耐药率分别为1.2%(2/170)、1.2%(2/170)、15.3%(26/170)、0.6%(1/170)；耐药水平多为低度耐药，NNRTIs类耐药位点主要是V179D/E与其他位点协同出现，另有84.1%(143/170)单独携带V179D/E的感染者表现为潜在耐药；INSTIs类耐药位点为G163R，对EVG和RAL表现为低度耐药。在0.9% 最适基因距离阈值下构建分子网络，入网率为30.0%(51/170)，耐药株在男男同性传播人群和异性性传播人群之间传播，并且都携带耐药位点E138G和V179E。在整合酶区CRF55_01B与CRF01_AE和B亚型在5个位点突变频率差异较高(T215A、G134N、I135V)。结论:我国CRF55_01B感染者抗病毒治疗前即对NNRTIs类药物耐药率较高，携带E138G和V179E耐药位点的毒株存在成簇传播，CRF55_01B整合酶抑制剂耐药株处于低水平流行，但整合酶基因区存在的高突变率的遗传性多态性位点对药物敏感性有潜在的影响，所以新型重组毒株耐药对我国抗病毒治疗的影响还需要进一步监测和分析。

目的:探讨基于甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）仿生微环境与悬滴法三维培养小鼠毛乳头细胞（DPC）制备仿生毛乳头球的生物活性及其在裸鼠中的毛发诱导功能。方法:采用实验研究方法。采用酶消化法获取雄性5~6周龄C57BL/6J小鼠触须毛的DPC以及1 d龄C57BL/6J小鼠皮肤角质形成细胞（KC），经免疫荧光法鉴定前者第3代细胞稳定表达DPC标志物神经细胞黏附分子、碱性磷酸酶（ALP）、β连环蛋白及α平滑肌肌动蛋白，后者原代细胞稳定表达KC标志物角蛋白15。取第8代DPC，用GelMA重新悬浮并接种至Transwell孔板插件底面，光交联后倒置培养，于光学显微镜下观察培养0（即刻）、3 d GelMA悬滴中DPC聚集情况（聚集成球即仿生毛乳头球），采用活/死染色试剂盒检测培养3 d仿生毛乳头球中细胞活性。将传统二维培养的原代DPC、第8代DPC以及按前述方法制备的仿生毛乳头球分别设为原代DPC组、第8代DPC组、仿生毛乳头球组，利用高通量测序技术平台对每组培养3 d的3个样本中DPC进行转录组测序，利用基迪奥生物信息云工具平台（OmicShare Tools）对转录组数据进行主成分分析、Pearson相似性分析、差异表达基因筛选，利用时间序列趋势分析软件对差异表达基因进行表达模式聚类分析，利用基迪奥生物信息云工具平台对具有特定表达模式的差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。同前进行细胞分组，采用随机数字表法从差异表达基因中抽取性别决定区Y框蛋白8（ SOX8）、基质金属蛋白酶9（ MMP- 9）、26型胶原纤维α1（ COL26A1）、无翅型MMTV整合位点家族成员6（ Wnt6），采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法验证差异表达基因mRNA表达情况与测序结果的一致性（样本数为9）；采用实时荧光定量RT-PCR法检测DPC生物功能标志物成纤维细胞生长因子7（FGF7）、Wnt10a、淋巴样增强因子1（LEF1）、ALP、β连环蛋白、多功能蛋白聚糖、SOX2的mRNA表达情况（样本数为9）。取3只5~6周龄雄性BALB/c裸鼠，分别设为原代DPC组、第8代DPC组、仿生毛乳头球组，将原代DPC、第8代DPC、仿生毛乳头球分别与原代KC以2∶1细胞数比例混合后分别注射至相应组别裸鼠皮下，每只注射6个区域。注射后2周，取注射区域全厚皮，计数再生毛发，行苏木精-伊红染色后观察再生毛囊情况。对数据行单因素方差分析、Tukey检验并进行Bonferroni校正。 结果:培养3 d，DPC在GelMA悬滴中由培养0 d的分散状态聚集成仿生毛乳头球，制备的仿生毛乳头球中细胞活性良好。培养3 d，主成分分析显示，相比于第8代DPC组，原代DPC组、仿生毛乳头球组组内样本间变异程度较低，仿生毛乳头球组与原代DPC组组间样本变异程度最低，3组DPC样本超过90%的基因谱数据变异可由第1个和第2个主要成分来解释；Pearson相似性分析显示，组内样本重复性好，原代DPC组和仿生毛乳头球组样本间的相关系数为0.84~0.95，原代DPC组和第8代DPC组样本间的相关系数为0.72~0.87；3组DPC间差异表达基因分析筛选出642个组间交集差异表达基因，对其进行表达模式聚类显示有2种基因表达模式有显著趋势（ P<0.05），分别为第8代DPC组基因表达显著低于原代DPC组/仿生毛乳头球组、第8代DPC组基因表达显著高于原代DPC组/仿生毛乳头球组，共包含411个差异表达基因；KEGG富集分析显示这411个差异表达基因在Wnt信号通路以及磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路显著富集（ P<0.05），GO富集分析表明细胞外基质、经典Wnt信号通路、细胞分化等GO术语被显著富集（ P<0.05）。与原代DPC组、仿生毛乳头球组比较，第8代DPC组细胞基因 SOX8、MMP- 9、COL26A1、Wnt6 mRNA表达量均明显下降（ q=15.950、8.854、11.890、11.050，9.851、5.884、7.418、4.870， P<0.01），与测序数据一致。与原代DPC组、仿生毛乳头球组比较，第8代DPC组细胞生物功能标志物FGF7、Wnt10a、LEF1、ALP、β连环蛋白、多功能蛋白聚糖、SOX2 mRNA表达量均明显下降（ q=11.470、9.795、4.165、9.242、10.970、10.570、8.005，7.472、4.976、3.651、4.784、5.236、6.825、5.214， P<0.05或 P<0.01）。注射后2周，第8代DPC组裸鼠无毛发再生，仿生毛乳头球组与原代DPC组裸鼠再生毛发数量相近（ q=1.852， P>0.05）且均显著高于第8代DPC组（ q=18.980、17.130， P<0.01）；第8代DPC组裸鼠注射区域皮肤仅形成了坏死灶，而仿生毛乳头球组与原代DPC组裸鼠注射区域皮肤均观察到再生毛囊且毛囊横断切面有黑色素沉着。 结论:基于GelMA仿生微环境与悬滴法三维培养小鼠DPC制备仿生毛乳头球的培养模型可一定程度上恢复高传代DPC在裸鼠中的毛发诱导能力，且其生物特性更加类似于原代DPC，可实现DPC的扩增后特性恢复。

目的:分析河南省抗反转录病毒治疗(ART)失败的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染/艾滋病(AIDS)患者基因型耐药的情况及其影响因素，为调整ART方案、减少耐药提供依据。方法:纳入2018年1月至2022年12月河南省接受ART 24周以上并出现病毒学失败(HIV RNA≥500拷贝/mL)的HIV感染/AIDS患者，收集基线CD4 ＋T淋巴细胞计数、ART方案等临床资料，并于郑州市第六人民医院进行HIV-1基因亚型及其耐药序列突变检测，将序列提交美国斯坦福大学HIV耐药解释系统比对检测结果，确定对核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂(INSTI)的基因型耐药结果。采用多因素logistic回归分析ART失败患者发生耐药的影响因素。 结果:982例HIV感染/AIDS患者中899例成功扩增获得序列，检出耐药737例，耐药率为81.98%(737/899)，其中对NRTI、NNRTI、PI、INSTI的耐药率分别为71.97%(647/899)、79.31%(713/899)、5.23%(47/899)和2.72%(20/734)。737例耐药患者中发生2类药物同时耐药者最多，占79.78%(588/737)，主要为NRTI＋NNRTI耐药[79.10%(583/737)]；99例(13.43%)仅发生1类药物耐药，48例(6.51%)发生3类药物同时耐药，2例(0.27%)对上述4类药物均耐药。共检测到10种HIV-1基因亚型，其中B亚型最多，占59.73%(537/899)，其次为流行重组型(CRF)01_AE亚型[21.91%(197/899)]和CRF07_BC亚型[9.45%(85/899)]。基线CD4 ＋T淋巴细胞计数、ART方案和HIV-1基因亚型是耐药发生的独立危险因素，基线CD4 ＋T淋巴细胞计数<100/μL的患者发生耐药的风险是CD4 ＋T淋巴细胞计数≥250/μL的4.55倍[95%可信区间( CI) 2.69～7.70]；使用2NRTIs＋NNRTI方案的患者发生耐药的风险是使用2NRTIs＋INSTI方案的4.51倍(95% CI 1.75～11.63)；感染B亚型和CRF01_AE亚型的患者发生耐药的风险分别是感染CRF07_BC亚型的2.18倍(95% CI 1.10～4.29)和2.70倍(95% CI 1.26～5.78)。 结论:河南省ART失败的HIV感染/AIDS患者基因型耐药发生率较高，基线低CD4 ＋T淋巴细胞水平、2NRTIs＋NNRTI治疗方案、B亚型和CRF01_AE亚型是患者发生耐药的危险因素。